全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉酶实验报告
草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖化酶的实验
5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。
1.3应用范围
枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应该比较广泛,在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛,是一种多功能的微生物.
3.发酵培养基的灭菌每组配制13L牛肉膏蛋白胨液体培养基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳胶管小心地加入发酵罐中，然后旋紧塞子，安装好防护罩（见图7），按下面的方法灭菌：
（1）检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常。如正常即可灭菌。
（2）打开进水阀，调节水压使水压表指针指示在0.2~0.4之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器。（出水阀近关闭情况下，达到0.4，此时出水阀虽然关闭，但进水阀打开，此外水压也满足要求，所以水能充满加热器不至于烧坏，当灭菌结束降温时，热水会走另一条旁路（非出水阀的另一条出口）泄压。）
本科学生综合性实验报告
学号
学院专业、班级
实验课程名称枯草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖
化酶的活性测定
教师及职称
开课学期2013至2014学年下学期
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
实验序号
实验三
实验名称
枯草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖化酶的活性测定
实验时间
2013.4.7-2013.4.14
实验室
总之，本次实验的学习，让我们深刻体会到了合作学习的重要性，以及严谨的科学态度的重要性。在今后的学习中我们会更加珍惜这样的学习机会，并尽力做到最好的。
教师评语及评分：
签名： 年 月 日
4、使用固体原料，在发酵过程中，糖化和发酵过程同时进行，简化操作工序，节约能耗。
枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及分离纯化
枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化摘要：以枯草芽孢杆菌（B.subtilis HN503）的基因组 DNA 为模板,运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。
SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化，PAGE进行纯度鉴定。
1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据1.1.1α-淀粉酶及其应用α- 淀粉酶(α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，是一种重要的淀粉水解酶。
它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4 葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取，而工业中主要应用的是真菌和细菌α- 淀粉酶。
目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶[1]。
α- 淀粉酶在淀粉工业中的应用。
α- 淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产, 主要用于淀粉的糖化和液化，其水解产物如葡萄糖和果糖有着高甜度，被广泛用于饮料工业中软饮料的甜味剂。
在冷饮制作中，由于淀粉糊具有老化的物理性质，低温静置会形成不溶性的硬性凝胶块，影响冷饮的质量及口感。
α-淀粉酶的加入，能很快将淀粉水解到糊精和低聚糖范围大小的分子,使料液粘度急速降低，流动性增高,从而保证了高淀粉冷饮的质量,使其在口感上更适合于人们的需要。
工业生产中, 淀粉的液化是将α- 淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化[2-3]。
α- 淀粉酶在焙烤工业中的应用。
α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品行业,适量的α-淀粉酶可改良面包品质,用于面包工业[4]。
α- 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大, 纹理疏松; 提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构, 增加内部组织的柔软度; 产生良好而稳定的面包外表色泽; 提高入炉的急胀性; 抗老化, 改善面包心的弹性和口感; 延长面包心储存过程中的保鲜期[5]。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案报告
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm 的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
枯草芽孢杆菌发酵的实罐操作
空气系统的要求
▪ 防止空气带菌主要是提高空压机进口空气 的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过 滤器失效。
▪ 提高空压机进口空气的洁净度，可以从提 高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤 着手。防止空气夹带油、水，除加强去除 油、水的措施外，还必须防止空气冷却器 漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力， 防止冷却水进入空气系统。
实训意义
▪ 生化工艺实训是为了让学生掌握一定的生 物化工工艺单元操作基本技能的基础上进 行的一次综合性实践训练。主要对有机品 发酵过程中常见的单元操作过程及设备进 行的基本操作技能训练。
防止染菌的要点
▪ 染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就 不能实现优质高产。影响染菌的因素很多， 而且带随机性质，但只要认真对待，过细 地工作，染菌是可以防止的。请到左边的 导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。
值。以1%淀粉溶液直接加热煮沸再加DNS试剂反
应作为空白。
七、发酵过程中参数检测结果
时间 1 2 3 4 5
酶活 0.2925 0.97115 2.1715 6.0168 4.9754
生长量 0.286 0.266 1.25 2.55 4.25
PH值 7.2 7.0 7.2 7.3 7.5
酶活曲线
蒸汽系统的要求
▪ 重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带 大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动， 保证生产时所用的蒸汽压力在30～35千帕 以上。
▪ 1、连续灭菌设备：连消塔结构要求简单， 易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混 合均匀，并易于控制温度。
▪ 2、发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严 密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡与 物料、空气、下水道连接的阀门都必须保 证严密度。
▪ 3淀粉酶活力的测定：
实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应
实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应、抗菌素生物效价的评价及裂解性噬菌体效价测定（-----结果分析）•实验目的与要求：•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。
学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。
学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。
•2、学会裂解性噬菌体效价测定方法。
•3、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。
一、紫外诱变枯草芽胞杆菌效应• 1.紫外诱变过程：•紫外线诱变采用15W紫外线杀菌灯；在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热；灯与处理物的距离为30cm；无菌取菌悬液使其厚度为0.5～1.0cm，放在紫外灯的照射台上，开启电磁搅拌器开关。
操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
•照射时间：未照射前（0时），照射1min，照射2min，照射3min时分别取样0.5ml；每照射到时间马上无菌取样，加到已经编号的第1个试管，为10-1，共有4个时间的10-1 ，分别将其稀释至：•0min 1min 2min 3min•稀释度10-610-710-8 10-610-710-8 10-510-610-7 10-410-510-6•每个稀释度各取0.2ml涂平板，共涂12块平板，做好标记，37℃培养48hr。
• 2.计算致死率•（1）对照样品中活菌数：将培养至48h后对照古板取出进行细胞计数，根据平板上菌勤务员落数，计算出对照样品1ml菌液中的活菌数。
同样方法数出紫外线处理1、2、3min后的细菌数。
•（2）致死率计算：（3）画出致死率曲线：横坐标为照射时间，纵坐标为致死率。
• 3.观察诱变效应•在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
•分别测量透明圈菌落计算比值（HC值），与对照平板进行比较。
二、抗菌素滤纸片法测定生物效价• 1.实验操作过程：•（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定
微生物综合实验报告土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院班级：生物技术121班姓名：学号：一，摘要本次实验选取广大的土壤，使用五点法采样，并制备出土壤悬液。
然后将土壤悬液的上清液分四个梯度稀释，使用平板划线法反复进行分离纯化，得到纯净的菌株。
我们得到菌株后，采用形态学的辨别方法，单染色，芽孢染色，革兰氏染色，淀粉水解实验，温度实验，糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），VP试验，MR试验，吲哚试验，柠檬酸盐利用实验，耐盐性试验，硝酸盐还原实验，明胶液化试验，运动性穿刺试验，酪素水解试验，卵黄实验等方法检验，查阅伯杰氏手册后，鉴别其为蜂房芽孢杆菌。
二，材料与方法1 材料1.1 试剂碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL；单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红；革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。
芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。
V.P试验：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。
吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。
硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）；酪素水解：牛奶；酪氨酸水解：L-酪氨酸；淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。
1.2仪器：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸等。
恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。
1.3 培养基筛选及活化培养基淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。
斜面种子培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4；摇瓶发酵培养基称取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0．3 g，氯化钠0．5 g溶于100 mL蒸馏水中。
产枯草芽孢杆菌实训报告
摇瓶发酵培养基优化
实验步骤 依照优化培养基配方制备相应试剂，每个 配方平行试验两次 灭菌：将12个摇瓶与高压蒸汽灭菌锅内进 行灭菌 121摄氏度 0.11MPa 15~20min
种子培养
接种：选取生长状况良好的试管斜面进行 接种，挑取活化菌接种到液体培养基中， 平行6个 培养条件：37摄氏度 摇床培养 注意事项： 确保在灭菌环境中进行 对培养基进行标注，以免混淆
三、空罐灭菌
空气过滤器灭菌，灭菌后对空气过滤器通空气进 行保压，使压强保持在0.1~0.15mpa之间防止染 菌。 对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐 体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强 0.11mpa时，保持温度和压力20min。 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，进行泄 压。
接种 在无菌环 境下进行
六、发酵
发酵条件：37摄氏度、压强0.07kpa、搅 拌转速200r/min 取样：取样前用热蒸汽将出料口处进行灭 菌10min。 发酵参数的测定 1、PH值的测定：用精确的PH试纸测。
2、生长曲线：分光光度计波长600nm测od值（以相同稀释倍数的培 养基做空白）。以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线 图。 3、淀粉酶活力的测定： 1)样品液的制备： 发酵液离心处理：8000rpm，5min 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液与37摄氏度水浴反应，然后沸水 浴5min终止反应。
葡萄糖标准曲线 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 -0.02 0 y = 0.0614x - 0.0029 2 R = 0.9859
光吸收值nm
系列1 线性 (系列1)
产淀粉酶枯草芽孢杆菌
“生物制药技术实训”课程研究报告项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌一实验原理枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。
由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。
利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。
根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。
二材料灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。
三操作步骤1.包平板2.配生理盐水3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。
取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。
9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
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20L全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉酶实验实验时间：2012年6月17日—2012年6月28日学生姓名：xxxxxx学号：院系：生命学院专业：生物技术指导教师：2012年6月30日目录一. 实验目的要求 (4)二、实验试剂和仪器 (4)1、种子培养基：57＃培养基 (5)2、发酵培养基 (5)3、发酵过程中相关参数的测定 (6)三、实验步骤与方法 (6)1、了解发酵罐系统的结构 (6)2、种子培养 (6)3、发酵罐空消 (6)4.PH电极与DO电极的首次校正 (8)5、发酵培养基的配置 (9)5.1 培养基摇瓶试验 (9)5.2 种子的摇瓶 (9)6.装料 (10)7、实消 (10)8.PH电极与DO电极的再次校正 (10)9、接种 (11)10、设定发酵参数，运行发酵指令 (11)11、发酵过程中相关参数的记录 (11)12、发酵过程中取样及相关参数的测定 (12)（1）参数测定所需的溶液的配置 (12)（2）取样 (13)（3）样品处理 (13)（4）残糖含量测定（DNS法） (13)（5）生物量的测定（比浊法） (14)（6）淀粉酶发酵活力的测定 (14)（7）葡萄糖标准曲线的制作 (15)（8）麦芽糖标准曲线的制作 (15)13. 放料,清洗罐体，空消，保养 (16)四、实验结果与讨论 (17)五. 实验心得体会 (26)一、实验目的要求：1.掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构(1)发酵罐主体(2)蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作(3)通气系统(4)加热冷却循环系统：各管道联络关系(5)搅拌动力系统(6)智能控制系统2.掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，参数设定3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。
4.运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律。
二、实验试剂和仪器1、种子培养基：57＃培养基试剂及药品：麸皮50g豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30gNaCl 2 g蒸馏水、斜面培养的枯草芽孢杆菌器材：1000ml烧杯、玻璃棒、100ml锥形瓶（20个）、天平、粉碎机、电热炉、高压灭菌锅、灭菌枪头、1000移液枪、酒精灯、75%酒精、棉球、无菌操作台、封口膜、橡皮筋、恒温摇床、1000ml锥形瓶、标签纸2、发酵培养基：试剂及药品：麸皮（3％）320g12水磷酸氢二钠（0.2％）70.55g硝酸钾（0.2％）28g消泡剂（植物油）（0.3％）42g蒸馏水器材：1000ml烧杯、玻璃棒、75%酒精、棉花、一次性口罩、打火机、厚手套、天平3、发酵过程中相关参数的测定的药品、仪器：试剂及药品：无水葡萄糖0.1gNaOH 4g3水乙酸钠0.6804g淀粉1g乙酸、蒸馏水、DNS、PH标准缓冲液、亚硫酸钠器材：10mL具塞刻度试管（30个）、100ml容量瓶（2个）、200ml 容量瓶（2个）、100ml烧杯、100ml试剂瓶（4个）、100ml锥形瓶（2个）、玻璃棒、1000ml烧杯、标签纸、电热炉、木夹、试管架、PH标准试纸、PH计、枪头、1000移液枪、恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、烘箱、冰箱、上海高机SY-3000发酵系统三、实验步骤与方法1、了解发酵罐系统的结构（1）．罐体（2）．发酵罐的搅拌系统（3）．空气供给系统（4）．温度控制系统（5）．pH控制系统（6）．过程变量的测量（7）．灭菌系统（8）测量及控制系统：下位机、上位机、网络通讯2、种子培养（1）称取麸皮50g、豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30g（用粉碎机搅碎为粉末）,上述成分混合于1000ml烧杯中，加NaCl 2 g、蒸馏水1.0L 置于电热炉上煮沸1小时，将pH 自然，待温度下降后分装入20个100ml 锥形瓶中，每瓶30ml。
将装有培养基的锥形瓶与备好的枪头、玻璃棒一起放入高温灭菌锅灭菌2小时后取出待用。
（2）将灭菌后的培养基、枪头、移液枪、玻璃棒、无菌水、酒精棉球、酒精灯放入无菌操作台紫外照射20min后，可将斜面培养的枯草芽孢杆菌接种到新配置的锥形瓶培养基中，贴好标签，放到30℃恒温摇床中培养2天。
3、发酵罐空消空罐灭菌注意事项和准备：i.在灭菌之前一定要先将夹套的水排掉。
ii.所有罐体上的部件都必须保证是安装可靠的，以防罐压升高时造成危害。
iii.空罐灭菌时，pH、DO电极应取下，这样可以延长使用寿命。
iv.将罐体及管路上的所用阀门都关闭。
v.调整好液位和消泡电极的位置并旋紧。
如果不用，则可拆下并用堵头封住；检查蒸汽是否满足要求。
步骤：（1）发酵罐、空压机电源打开；（2）打开蒸汽发生装置，发酵罐与蒸汽发生装置的通水阀门打开，并检查蒸汽发生装置水箱是否满，注意蒸汽发生装置的压力表读数。
打开蒸汽发生装置的旁通阀使冷空气排出，排完即关。
（3）打开发酵罐水阀，使水淹没温度电极，排空夹套水。
（4）当蒸汽发生装置的压力表读数达到0.4～0.7MPa，可开启空消，下位机参数设置如下：灭菌温度：121.0℃灭菌时间： 20min停转温度： 90.0℃灭菌转速： 0rpm结束温度： 37.0℃结束转速： 150rpm结束压力： 0.05MPa 结束流量： 30L/min尾气开度： 5% 过程流量：5.00 L/min（5）当罐温达到100℃以上，分别对取样口、轴封、底阀进行消毒，每项10min。
取样口消毒：打开取样蒸汽进气阀—取下取样口螺盖—取样口出蒸汽—打开取样蒸汽出气阀—拧上取样口螺盖—计时10min（正常灭菌状态下取样相通管道会发烫），轴封与底阀的灭菌过程与取样口灭菌操作类似。
（6）空消完成后关闭蒸汽发生装置，降温冷却。
4.PH电极与DO电极的首次校正（1）配置PH为4.00与6.86的标准缓冲液（2）配置饱和亚硫酸钠溶液（3）PH电极的校正：①.将PH电极放入6.86的标准缓冲液中，在“测量值1”处输入6.86，“当前电压”稳定后，点击“第一点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。
②.将PH电极放入4.00的标准缓冲液中，在“测量值2”处输入4.00，“当前电压”稳定后，点击“第二点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。
③.电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。
（4）DO电极的校正：①.将DO电极放入饱和亚硫酸钠溶液中，在“当前电压”稳定后，点击“第一点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。
②.将DO电极放入饱和湿度的空气中（用湿润滤纸包裹电极亦可），在“测量值2”处输入标准值98，“当前电压”稳定后，点击“第二点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。
③.电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。
5、发酵培养基的配置：用天平称取麸皮320g、12水磷酸氢二钠70.55g、硝酸钾28g、植物油42g，将12水磷酸氢二钠、硝酸钾和植物油用蒸馏水溶于1000ml烧杯中制成营养盐。
5.1 培养基摇瓶试验5.1.1 材料4%麸皮：100ml×4%=4g磷酸氢二钠：100ml×0.2%=0.2g硝酸钾：100ml×0.2%=0.2g5.1.2 方法将上述药品装入250mL的三角瓶中，35o C旋转式摇床上（150rpm）培养26小时。
判断培养基的粘稠度，如果过于粘稠降低麸皮的含量。
5.2 种子的摇瓶按上述方案配好培养基3份（或2份），进行高温灭菌30min。
再将枯草芽孢杆菌种接入摇瓶培养基中，35o C旋转式摇床上（150rpm）培养26小时。
6.装料：将配好的营养盐与称好的麸皮从进料口倒入发酵罐，加水（约5升）至淹没温度电极。
7、实消：操作步骤与空消类似。
区别在于：（1）下位机参数设置如下：灭菌温度： 121.0℃灭菌时间： 30min停转温度： 90.0℃灭菌转速： 100rpm结束温度： 37.0℃结束转速： 150rpm结束压力： 0.05MPa 结束流量： 30L/min尾气开度： 5% 过程流量：5.00 L/min（2）实消完由于要取样故蒸汽发生装置不可关闭。
8.PH电极与DO电极的再次校正（1）DO电极校正：搅拌速度与发酵过程正常转速一致，通气量与发酵过程正常通气量一致，标定溶氧为“100”本实验设定118.3%时为100%溶氧。
（2）取样（参比液）：打开取样蒸汽进气阀—取下取样口螺盖—取样口排出蒸汽—关闭夹套蒸汽阀—取样口蒸汽排完—关闭取样蒸汽进气阀—拧松取样阀（开启方向与正常螺旋相反）—取样口流出发酵液—取样100ml于灭菌锥形瓶（作为参比液存于4℃冰箱）—打开取样蒸汽进气阀—取样口排出蒸汽（待冲净取样口）—拧上取样口螺盖—蒸汽从取样阀排出—打开取样蒸汽出气阀—拧紧取样阀—灭菌10min—关闭蒸汽发生装置。
（3）测出参比液PH值，以此数值对PH电极校正，本实验测得参比液PH值为7.14，故将下位机此时PH值调为该值。
9、接种：当罐温降低至40℃以下时，采用火圈法接种摇瓶种子。
（1）接种前需将20瓶100ml种子液在无菌操作台上混合成两大瓶，以便于接种。
（2）用75%酒精擦拭进料口的罐面，用蘸酒精的棉花填满进料口凹槽，接种人员佩戴好口罩，点燃进料口棉花（在接种过程中保持或不灭），将菌液倒入罐中。
（3）接种完成后加入蒸馏水时发酵液体积达到规定液面。
10、设定发酵参数，运行发酵指令（1）设置参数:温度：37℃通气量：10L/min维持正压： 0.05MPa搅拌速度 250rpmpH自然运行指令（2）发酵起始参数：罐温37.4℃转速150rpm PH7.36 DO231.3% 流量14.12L/m 罐压0.054MPa11、发酵过程中相关参数的记录制定值班表，自发酵开始每半小时记录一次（深夜除外），记录的内容有：罐温、转速、PH值、DO值、流量、罐压、发酵液颜色、发酵液浊度、泡沫高度、泡沫大小、发酵罐进气压力、发酵罐尾气压力。
发酵过程中的注意事项：①.发酵罐压力（进气、尾气）应小于0.15MPa②.出现一般异常情况可临时关闭蒸汽发生装置，但不可关闭发酵罐与空压机电源③.发酵过程中，取样前应打开蒸汽发生装置，待其压力达到0.4～0.7MPa时才能取样。
12、发酵过程中取样及相关参数的测定（1）参数测定所需的溶液的配置：①pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液的配置：利用公式pH=pKa+lg([AC]/[HAC])HAC的pKa=4.74代入得[AC]/[HAC]=7.24所以只要醋酸钠和醋酸的物质的量之比为7.24即可。
得出需乙酸0.00397 ml，3水乙酸钠0.6804g，将3水乙酸钠0.6804g溶于适量水中，加入冰乙酸0.00397 mL，用水定容至100 mL。