质粒转染protocol
转染protocol
转染protocol
注意：整个过程要防止293T细胞漂，所以动作一定要轻缓，不要急。
一、细胞准备
转染前12-18小时，铺细胞。
293T 细胞，介于1:2~~1:3传。
二、转染前换液
吸去细胞上层培养基，轻轻地加入PBS（14.5cm皿需要至少5ml培养基），缓慢地晃动培养皿，然后吸去PBS。
轻轻地加入10ml Opti-MEM。
然后放回细胞培养箱。
三、PEI稀释，DNA与PEI混匀
抗体重链与轻链质粒比例按照1：2.5混匀；质粒与PEI按照1：1混匀。
（质量比，PEI 为1ug/ul）；每14.5cm皿可以转染40ug质粒。
每皿我们需要1-2mlPEI&DNA混合液（Opti-MEM稀释）。
首先计算好抗体重链、轻链所需质粒，PEI需要量以及二者混合后最终体积。
然后，取一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入PEI，Vortex，净置5分钟。
取另一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入DNA，Vortex。
将PEI稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀。
静置20分钟。
（尽量避光）
四、轻轻地将PEI&DNA混合液加入细胞培养皿中（1-2ml/皿）。
缓慢晃动培养皿，混匀。
然后放回细胞培养箱。
五、一小时后，吸去Opti-MEM，每皿加入20ml 293freestyle培养基。
（动作轻缓）
六、4天后，收上清。
质粒转化、细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。
IP Protocol
IPProtocol1.铺板：按一定细胞数将细胞接种于培养皿内，24h后进行处理。
（转染质粒时，细胞长到90%以上较为合适。
一次IP，使用6孔板足够。
）2.转染：lipo2000转染质粒，质粒转染效果应该提前验证。
（IP转染质粒时，被拽的一个蛋白可以适当加大转染量；如IP FLAG，用FLAG拉HA，总转染体系500ng时，对照组转空载质粒500ng；FLAG组转200ngFLAG＋300ng 空载；HA组转300ngHA＋200ng空载；共转组300ngHA＋200ngFLAG。
）3.细胞裂解：将培养皿置于冰面，弃培养液，预冷PBS洗一遍。
加入事先配置好预冷的lysis buffer ＋PMSF＋cocktail+Na3VO4等（如果是蛋白修饰反应需额外加）(6孔板每孔可加入1ml), 放置4℃摇床摇10min，裂解细胞。
如皿底裂解不完全，可以用枪轻轻吹打几次。
（裂解后皿底可见白色的丝状物，为DNA等成分。
此步最好不要vortex。
）4．离心：4℃12000 rpm离心15min，上清即为裂解后的蛋白样品。
5. Beads准备：取出Beads(交联了IP抗体的Agarose Beads),使用前混合均匀。
另取一只15ml离心管，根据每个样品1ml的用量加入相应的lysis buffer,然后以每个样品10-20ulBeads的量将Beads加入lysis buffer中，充分重悬后，分装至1.5ml EP管内，4℃ 1000-2000rpm离心2min。
弃上清（不要完全吸干，上样枪头）。
6. 将步骤4中离心后上清转移到新的硅化EP管内。
①每个样品各取出80ul做为input。
②IP：每个样品各取800ul上清加入事先备好的Beads中，放置于4℃转子上旋转充分孵育2h。
(孵育的时间需要调整，一般外源过表达IP 2-4H足够；若互作为底物反应，在IP 前需要适当加入的MG132或其它相应的抑制剂。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是现代生命科学研究中常用的实验手段之一，广泛应用于基因工程、细胞生物学、分子生物学等领域。
本文将从质粒转染技术的原理、方法和应用等方面进行介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染技术是指将外源质粒DNA导入到细胞内的一种方法。
质粒是一种环状DNA分子，具有自主复制和表达基因的能力。
质粒转染技术通过将质粒DNA导入到细胞内，使其在细胞内复制和表达，从而实现对目标基因的研究和应用。
1. 化学法转染：化学法转染是最常用的质粒转染方法之一。
其基本原理是利用化学物质（如聚合物、脂质体等）与质粒DNA结合，形成复合物后与细胞膜发生相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于大多数细胞类型。
2. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压电脉冲的作用，瞬时破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞内。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但操作较为复杂。
3. 粒子轰击法转染：粒子轰击法利用高速粒子（如金属微粒）的撞击作用，将质粒DNA导入细胞内。
这种方法适用于质粒DNA较大、难以通过其他转染方法的细胞。
三、质粒转染技术的应用1. 基因表达研究：质粒转染技术可用于将外源基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而研究基因的结构、功能和调控机制。
2. 基因敲除研究：质粒转染技术结合CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除，从而研究该基因的功能。
3. 基因治疗：质粒转染技术可用于将治疗基因导入患者的细胞，修复或替代异常基因，实现基因治疗的目的。
4. 细胞药物递送：质粒转染技术可用于将药物敏感基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而增强对药物的敏感性，提高治疗效果。
四、质粒转染技术的进展与挑战随着生命科学研究的不断发展，质粒转染技术也在不断改进和完善。
目前，研究人员正在努力提高转染效率、降低细胞毒性和改善转染的特异性等方面。
同时，也面临着一些挑战，如如何选择合适的转染方法、如何提高质粒的稳定性等问题。
质粒大抽protocol（用QIAGENMaxiColumn）
质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)2003/4/28陈俊1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。
2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。
3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过夜后，放入-70℃冰箱中。
并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。
4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500rpm）。
5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。
然后将悬浮液转到50ml的离心管中。
6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。
样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。
7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。
后再一次混匀样品．20000g，4℃离心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul （sample 1）以备检测分析8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。
用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。
质粒转染技术
质粒转染技术1. 引言质粒转染技术是一种常用的实验手段，用于将外源DNA转移到细胞中。
通过质粒转染技术，研究人员可以研究基因功能、调控基因表达以及制作重组蛋白等。
本文将介绍质粒转染技术的原理、方法和应用。
2. 原理质粒转染技术的原理是通过电穿孔、离子共价结合、化学反应或病毒载体等方法，将外源质粒DNA引入细胞内。
一旦质粒DNA成功转移到细胞内，它可以在细胞中复制和表达。
质粒转染技术可以分为两种类型：转染和转化。
2.1 转染转染是指将质粒DNA引入细胞外的细胞中。
这种方法通常使用化学试剂或物理手段，如钙磷共沉淀、电穿孔、微粒轰击等。
这些方法可以破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞。
2.2 转化转化是指将质粒DNA引入细菌细胞中。
这种方法通常使用热冲击或电穿孔等技术，将质粒DNA引入细菌细胞内。
细菌细胞具有天然的转化能力，可以吸收外源DNA并将其整合到细菌染色体中。
3. 方法质粒转染技术的具体方法可以根据实验需求和细胞类型的不同而有所差异。
下面是一般的质粒转染方法的步骤：3.1 培养细胞首先，需要培养细胞以达到适当的细胞密度。
细胞密度的选择取决于实验的目的和细胞类型。
3.2 准备转染体系根据实验要求，制备适当的转染体系。
转染体系通常包括质粒DNA、转染试剂和培养基等。
3.3 转染将质粒DNA与转染试剂混合，并将混合物加入培养细胞中。
转染试剂可以帮助质粒DNA进入细胞。
3.4 培养细胞将转染后的细胞培养在适当的培养条件下，以促进质粒DNA在细胞中的复制和表达。
3.5 分析转染效率使用适当的检测方法，如荧光显微镜观察、PCR、Western blot等，来分析转染效率和质粒DNA在细胞中的表达情况。
4. 应用质粒转染技术在生命科学研究中有广泛的应用。
下面是一些常见的应用：4.1 基因功能研究通过转染外源质粒DNA到细胞中，可以研究基因的功能。
例如，可以将siRNA质粒转染到细胞中，来研究特定基因的沉默效果。
汉恒生物CRISPR protocol-2质粒构建和建系
---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系
汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各 种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务
说明
lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢 病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一各载 体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签， 载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。 验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成 慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常 方便。
oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考） ）
仅作参考
病毒包装体系
包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish， 6x106 293T）
4 μg 3 μg 1 μg lentiCRISPR v2-gDNA plasmid psPAX2 packaging plasmid pMD2.G envelope plasmid
单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）
（293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两 块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或 者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成 活的细胞系如，但是挑取的单克隆偶尔不纯，有时需要重新亚克隆）。
目的细胞系的感染/转染
转染 （2 g plasmid/60 mm dish，细胞密度60-80%）
【v2=lentiCRISPR v2，下同】
PEI转染试剂的Protocol
24孔板
1.90.8Fra bibliotek5012孔板
3.5
1.6
100
6孔板
9.6
4
250
6cm平板
21.5
8
500
10cm平板
56.7
16
1000
15cm平板
147
32
2000
4.将B液缓慢加到A液中并混匀，最好使用旋涡振荡器边加边震荡。然后室温放置20min。
5.将DNA-PEI混合液缓慢加入到细胞培养基中，轻轻混匀。
6.转染4h后更换为完全培养基。
培养皿面积(cm2)
转染DNA量（ug）
稀释DNA/PEI的培养基体积（ul）
96孔板
0.32
0.2
25
48孔板
1.1
0.5
PEI转染Protocol
1.转染前一天（24h左右）胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染时汇合度为70~90%。
2.转染前1h，将细胞培养基更换为Opti-MEM或者DMEM基础培养基（若使用Opti-MEM，PEI转染效果更佳）。
3.用一定体积的Opti-MEM稀释质粒，小心混匀，记为A液；用相等体积的Opti-MEM稀释PEI，小心混匀，记为B液（质粒：PEI=1：2，W/W)，室温静止5min。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是一种常用的分子生物学技术，用于将外源基因导入细胞中。
本文将从质粒转染的原理、方法和应用等方面进行详细介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染是指将质粒DNA导入目标细胞中，使其表达外源基因。
质粒是一种环状的双链DNA分子，通常存在于细菌细胞中，具有自主复制的能力。
质粒转染技术利用质粒的特性，将外源基因插入质粒中，然后通过物理或化学手段使质粒进入细胞内，从而实现外源基因的表达。
1. 钙磷法：将质粒DNA与钙盐形成复合物，然后将复合物添加到细胞培养基中，通过细胞摄取复合物实现质粒转染。
2. 电穿孔法：利用电场作用使细胞膜发生短暂通透，从而使质粒DNA进入细胞内。
3. 热激法：将细胞与质粒DNA进行热激处理，使细胞膜通透性增加，从而实现质粒转染。
4. 脂质体转染法：利用脂质体与质粒DNA形成复合物，然后加入细胞培养基中，通过脂质体与细胞膜的相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
三、质粒转染技术的应用1. 基因功能研究：通过转染特定的质粒载体，可以实现对目标基因的过表达、沉默或突变，从而研究基因在细胞中的功能。
2. 基因治疗：将治疗相关的基因载体转染到患者的细胞中，通过表达特定的基因来治疗疾病。
3. 转基因生物制备：通过转染特定的质粒载体，将外源基因导入植物或动物细胞中，从而制备转基因生物。
4. 药物筛选：将药物相关的基因载体转染到细胞中，通过观察外源基因的表达情况，评估药物的疗效。
5. 蛋白表达：将目标蛋白基因载体转染到细胞中，使细胞表达目标蛋白，用于蛋白的纯化和功能研究。
质粒转染技术是一种重要的分子生物学技术，通过将外源基因导入细胞中，实现基因功能研究、基因治疗、转基因生物制备、药物筛选和蛋白表达等应用。
随着技术的不断发展和完善，质粒转染技术将在生物医学研究和生物工程领域发挥越来越重要的作用。
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1. 细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105 至4×105 细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的30%）。
将细胞置于含5％
CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
转染前2 h 换
液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用480 μl 反应总体积，6孔板培养皿用240ul反应体系。
在灭菌水中加入质粒DNA（总量1－3 μg 为佳），
3.再加入48ul的10*HBS，vortex 3s左右，再加入24ul的5*CaCl2，vortex 10s
,静置12min，将磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2 的37℃温箱孵育。
8 h 后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放
置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。