极端微生物的特性及应用

极端微生物的特性及应用

摘要：依赖极端环境才能正常生长的繁殖的微生物，称为嗜极菌或极端微生物，极端微生物的类型有嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜酸微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜压微生物。其细胞中的DNA、RNA、蛋白质、脂类和多糖成分，以及其代谢途径、基因表达、抗逆性机制等都与一般生物不同，近年来倍受各国学者们的重视。

关键词：嗜热微生物；嗜冷微生物；嗜酸微生物；嗜碱微生物；嗜盐微生物；嗜压微生物

1.引言

嗜极菌是指生活在各种极端恶劣环境下的微生物。极端环境的如高温、低温、高压、高酸、高碱、高盐、高渗、干旱以及含高浓度的有机溶剂、重金属或其他有毒物质的环境或高辐射环境等。凡依赖这些环境才能正常生长的繁殖的微生物，称为嗜极菌或极端微生物，极端微生物的类型有嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜酸微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜压微生物。其细胞中的DNA、RNA、蛋白质、脂类和多糖成分，以及其代谢途径、基因表达、抗逆性机制等都与一般生物不同[1]，因此不仅在生物学基础理论研究中具有重要意义，而且在生产实践（冶金、采矿、石油开采、特种酶制剂和代谢产物的生产等）中具有巨大的应用潜力。因此，近年来倍受各国学者们的重视。本文就极端微生物的功能特性、生理机制、工业应用及研究进展等各方面进行阐述。

2.极端酶

来自嗜极菌的酶称为极端酶，嗜极菌之所以能生长于超常生态环境条件下,与极端酶具有的非凡功能是分不开的。极端酶来自嗜极菌,但并非嗜极菌体内所有的酶都是极端酶。例如,嗜酸菌或嗜碱菌的细胞仍保持接近中性的内环境,其胞内酶仍属中性酶。但其胞外酶,如淀粉酶和蛋白酶等则不同，仅在极酸或极碱条件下起作用）[2]。由于适合极端酶生长的条件一般具有腐蚀性,并产生有毒物质,不能用常规发酵系统来生产,因而极端酶的分离纯化目前还限于小规模，低产量水平。

2.1极端酶的稳定因素[3]

仅有少数几种极端酶的晶体结构现已搞清楚。有关极端酶稳定因素的研究主要通过比较极端酶与相应中性酶的一级和二级结构,以及建立计算机模型来进行。1993年Rentier-Delrue小组研究了几种嗜冷酶,包括蛋白酶、脂肪酶和半乳糖苷酶,发现它们含有几个中性酶所没有的“额外”氨基酸残基。后来,Feller小组也得出相似的结论。他们建立的计算机模型表明,嗜冷蛋白酶含有大量带负电荷的氨基酸残基,特别是天冬氨酸残基分子表面的个极性环状结构呈伸展状态分子内缺少离子间作用与疏水作用。这些结构特征使酶分子呈较松散状态,具有较大的可变性,从而导致酶的稳定性降低。

有关超嗜热酶的研究表明,酶的分子结构与同源的中性酶基本相同,其稳定性可能来自许多微妙的作用,包括稍长的螺旋结构,三股链组成的β-折叠结构,C和N端氨基酸残基间的离子作用以及较小的表面环等。这些因素使超嗜热酶形成非常紧密而有韧性的结构,从而有利高温条件下酶的稳定。经与余种中性蛋白的结构相比较,发现中每个氨基酸残基所含离子对数目稍多。同时,有最小的溶剂暴露表面和最大的原子包理数。但这是否稳定的决定因素尚不肯定闭。此外,有人认为超嗜热菌体内存在阻止变性的热保护剂。显然,即使胞内溶质确有稳定超嗜热酶的作用,其机制也不尽一致相同。

与中性酶相比，嗜盐酶所含的酸性氨基酸比率较高,尤其是在分子表面。这些酸性氨基酸侧链能把水分子结合到酶的分子表面,形成一个水保持层,从而阻止酶分子相互凝聚。通过建立嗜酸α-淀粉酶的计算机模型,德国Bakker的等发现,与中性酶相比,酸性氨基酸残基的代换主要发生在分子表面,因而酶的电荷密度较低可能有利防止酶在低pH条件下分子间的静电排斥作用。嗜碱酶也具有类似特点[4]。据日本的Imanaka等的研究,一种丝氨酸蛋白酶的适宜pH为13，可能含酸性氨基酸较少,而精氨酸·赖氨酸的比例较高,因而在较高pH条件下,酶本身仍带有净电荷,从而具有稳定性。

由上述可见,有关极端酶稳定因素的研究才刚刚开始,尚有许多未知因素有待探索。深入研究极端酶的稳定机制,将促进极端酶的开发和利用,具有重大的理论和实践意义。

2.2 极端酶的应用

由于极端酶在超常条件下起作用,因而有一系列重要用途,尤其是在工业生产的极端温度、极端或有机溶剂条件下,极端酶的应用非常重要。

最典型的就是热的DNA聚合酶。它来自水生栖热菌,已被用于聚合酶链反应（PCR）。穆利斯因此而获得1993年度诺贝尔化学奖。据日本的Nakanishi报道,固定化的嗜热蛋白酶已被用于制造天冬甜精。该酶在乙酸乙醋/水的两相介质中,催化下列反应：N-卞氧基-L-天冬氨酸+L-苯丙氨酸甲酯——>天冬甜精前体,天冬甜精的生产能力达到10吨/m3月。细菌和真菌的淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖胺酶等,已被广泛用于淀粉加工工业。由于嗜热酶比相应的常温酶有更好的热稳定性,对酸、碱、有机溶剂等也有较好的抗性,因而嗜热及超嗜热淀粉酶在淀粉工业加工方面备受重视。目前,玉米糖浆的生产是通过中度嗜热的淀粉酶将玉米淀粉转化为高果糖浆。加工的最后一步,是在60℃由固定化葡萄糖异构酶催化葡萄糖转化为果糖。然而,果糖产量并不高。如果升高反应温度,将有利果糖产量的提高。因此,选用超嗜热的异构酶将有重要价值。

嗜碱酶主要工业用途之一是用作去污剂添加成份[5]。去污剂溶液的pH 通常为8.0-10.5。由于嗜碱酶耐碱,可用作去污剂的添加成分。Novo和Show-DenkoKK等工业公司已将嗜碱枯草芽抱杆菌的耐碱蛋白酶投入商品化生产。洗涤试验表明,去污剂中加入该耐碱蛋白酶,显著提高洗涤效率。由嗜碱枯草芽抱杆菌生产的碱性纤维素酶也用作洗涤剂的添加剂,并已品化生产。在日本,市场上的40%洗涤剂含有该酶添加剂。

其它研究表明,从深海嗜压菌分离的基因与蛋白质能适应高压条件。据此,嗜压菌及其嗜压酶可用于生产高压生物反应器,以及食品加工中的高压灭菌。

近几年来，国内外有关极端酶的研究发展很快，尤其是日本和欧美各国，但有关极端酶结构和功能统一机制还不是很清楚，因而其广泛应用受到限制，至今只有一小部分极端酶被分离纯化，应用于生产实践的极端酶则更少，如何更好地拓展极端酶的应用领域是大家共同关注的问题。就目前研究的现状来说，进一步加强对极端酶稳定机制的基础性研究，并将新的生物技术引入极端酶工程领域将是今后极端酶研究的主攻方向。

3.嗜热微生物

嗜热微生物按照耐热程度的不同可以分为五个不同类型：耐热微生物、兼性嗜热微生物、专性嗜热微生物、极端嗜热微生物和超嗜热微生物。耐热微生物最高生长温度在45-55℃之间，低于30℃也能生长。兼性嗜热微生物的最高生长温度在50。65℃之间，也能在低于30℃条件下生长。专嗜热微生物最适生长温度在65-70℃，不能在低于40。42℃条件下生长。极端嗜热微生物最高生长温度高于70℃，最适生长温度高于65℃，最低生长温度高于40℃。超嗜热微生物的最适生长温度在80-110℃，最低生长温度在55℃左右。大部分超嗜热微生物是古生菌，但真细菌中的海栖热袍菌也属于超嗜热微生物。嗜热微生物生长的生态环境有深海火山喷口附近、热泉、高强度太阳辐射的土壤、岩石表面和各种堆肥等。

嗜热微生物在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很重大的利用价值。

3.1 嗜热微生物细胞膜的组分及其耐热机制

嗜热菌细胞膜的脂双分子层中有很多结构特殊的复合类脂,主要是甘油脂肪酰二酯。随着温度的升高,复合类脂中烷基链彼此间隔扩大,而极性部分作为膜的双层结构则保持整齐状态—液晶态。嗜热菌的细胞膜通常通过调节磷脂组分而维持膜的液晶态,以获得更高的熔点。嗜热菌的细胞膜中含有异型脂肪酸、稳定型脂肪酸和环烷型脂肪酸,而无不稳定的不饱和型脂肪酸。增加磷脂酰烷基链的长度,增加异构化支链的比率,或是增加脂肪酸饱和度都可维持膜的液晶态,从而使嗜热菌的细胞膜耐受高温。

3.2嗜热菌蛋白和嗜热酶的耐热机制

决定嗜热菌耐热性的主要机制是蛋白质的热稳定性,在80℃以上环境中能发挥功能的酶称为嗜热酶。嗜热酶对不可逆的变性有抗性,并且在高温下(60℃-120℃)具有最佳活性,有的酶甚至在超过140℃时也能稳定一个小时以上,这样的酶在工业生产中有很大的利用价值。那么,嗜热酶在高温环境中是如何保持其稳定性的呢?

3.2.1氨基酸组成与热稳定性

蛋白质的氨基酸组成一直被认为与热稳定性有关,但嗜热酶中并不存在

与高温下酶活性有关的新氨基酸。一般认为由于Ala易于螺旋结构的形成,因此嗜热酶中常发生Gly →Ala的取代;Pro由于其结构熵比其他氨基酸小而更易折叠,且一旦折叠则需要很高的能量才能解折叠,这样在不影响其高级结构的前提下,Pro的替代可以提高整个蛋白质分子的热稳定性。带电氨基酸如Arg、Asp、His、Glu和Lys由于静电相互作用对蛋白质的构象稳定具有重要作用。Arg的几个性质表明其能更好地适应高温环境:Arg比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链,侧链所提供的疏水作用及离子间相互作用有助于提高蛋白质的热稳定性;Arg的δ-胍基比Lys的氨基提供了更大的表面积,有利于电荷之间的相互作用。Arg的pKa(约为12)比Lys的pKa(11.1)高了1个单位,Arg在高温下容易保持离子对和净的正电荷(温度升高pKa下降)。因此嗜热酶中Arg出现的频率较高。在α-螺旋中,具有β支链的氨基酸(Val、Ile、Thr)产生较大的构象张力而不利于螺旋的稳定,所以这些不稳定氨基酸在嗜热酶中出现的频率较低。已知Asn和Gln是热敏感的氨基酸,因为它们在高温下容易脱氨,因此嗜热蛋白中Asn和Gln出现的频率较低[6]。

3.2.2氢键

氢键不仅发生在多肽链分子内部或分子之间,也可以发生在肽链分子和周围的亲水基质之间。Vogt等证明蛋白质的热稳定性和氢键的数量呈正相关。Suvd等比较了BLA(B.licheniform is a2amylase)和BSTA(B.stearotherm ophilua2amylase)(BLA比BSTA的热稳定性好)的结构,发现BSTA中少了9个氢键,需要多耗费1kcal/mol的能量才能使其稳定。Eijsink等发现来自B.stearothermophilus的中性蛋白酶如果Ala170被Ser所替代其热稳定性增加了0.7℃因为Ser170可参与内部一个氢键的形成。Tanne等观察到32磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的热稳定性和带电基团中性基团之间形成的氢键数量呈正相关,并指出这些氢键比盐桥和中性基团之间形成的氢键更有利, Shirley研究了氢键对RNase T1稳定性的影响。RNase T1含有8个氢键,氢键的平均长度为2.95。这些氢键能为RNase T1构象的稳定提供110kcal/mol 的能量,个别的氢键可以提供1.3kcal/mol的能量。因为氢键的鉴定高度依赖于原子间的距离,而许多嗜热蛋白的晶体结构还没有测定或测定结构的分辨率不够高,通过结构分析研究氢键对结构稳定性的作用还不能提供明确的答

案。

3.2.3离子对[7]

离子对被认为是蛋白质折叠的重要稳定因子。经计算T4溶菌酶中每个离子对可提供3-5kcal/mol的能量使结构稳定。T.Maritima GDH中引入了涉及16个氨基酸残基、类似P.furiosus GDH中由18个离子对组成的网

络,结果突变酶的稳定性比野生酶有所提高。

3.2.4亚基之间的相互作用和亚寡聚体化

日益增多的资料显示嗜热酶比嗜温酶更倾向于寡聚体形式存在表1。研究表明,与E.coli的3-异丙基苹果酸脱氢酶相比,来自Thermus thermophilus 的3-异丙基苹果酸脱氢酶具有一个更疏水的表面,这样就使得其倾向于形成寡聚体,寡聚体的形成使得疏水的表面埋藏在分子的内部而实现稳定。SDM 实验也表明存在于亚基之间的疏水相互作用使得二聚体更稳定。T.thermophilus的延长因子EF2Ts二聚体之间界面上的一个疏水核心的突变表明该疏水核心与二聚体的聚合有关,而二聚体的形成对该酶的稳定性有重要作用。

表1 嗜热酶和嗜温酶的亚基数的差异

来源酶嗜热菌亚基数嗜温菌亚基数Pyrococcus woesei 磷酸甘油酸激酶 2 1 Methanoghem usfervidus 磷酸甘油酸激酶 2

Pyrococcus furiosus 葡萄糖苷酶 4 1

Sulfolobussolfataricus 葡萄糖苷酶 4

Thernotogamaritima 葡萄糖苷酶 2

T.matitima 邻氨基苯甲酸合成酶 2 1

T.maritima 二氢叶酸还原酶1或2 1

2 1

T.maritima 磷酸核糖邻氨基苯甲

酸异构酶

3.2.5二硫键

根据计算机分析、蛋白质结构和生物化学的研究已经清楚地表明在嗜热蛋白质中二硫键是热稳定的机制之一。在已知三维结构的嗜热蛋白质中,

有很多是通过二硫键将亚基连接起来形成多聚体的。Daniel等也检测到了P.aerophilum中存在丰富的含二硫键的蛋白[8]。研究表明P.aerophilum细胞中47%的半胱氨酸是形成二硫键的,而在E.coli中只有8%。同源蛋白的序列分析表明很多蛋白中大多数的半胱氨酸不是保守的，这意味着这些半胱氨酸与活性中心无关,只是与结构有关。