植物生理实验试题y

姓名：y 学号：107550400*** 专业：生物化学与分子生物学
第一题：
影响基因转化效率的因素主要有以下几方面，操作时，从这些方面考虑来提高转化效率、缩短再生时间。

1.农杆菌菌株
不同菌株对同一种目的材料的感染能力不同.其主要原因是农杆菌吸附数目与菌株类型有关, 而吸附是农杆菌感染植物细胞的最初步骤。

因此，选择合适的菌株对转化成功及转化效率的提高至关重要。

使用乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮及植物细胞培养液来诱导农杆菌,并在一些转化中取得好的转化效果。

已有实验表明,一些自身不能产生对Vir 基因具有高效诱导的酚类化合物的植物,使用乙酰丁香酮能产生较好的效果。

同样,在共培养时间短、难以诱导Vir 基因表达的情况下,酚类物质的使用可能会产生良好的效果。

乙酰丁香酮的使用还可以减小植物基因型的差异。

一般说来,农杆菌Vir 基因诱导必须注意以下几点:①诱导培养基pH 介于5～6 之间；②农杆菌培养温度应在28～30 ℃；③避免在培养基中含有酵母提取物；④培养基中需含有较高的糖浓度。

2.植物基因型及外植体类型
一般认为, 基因型的特异性与细胞的生理状态有关, 具体来说与细胞受伤后的生理反应(分泌酚类化合物, 增强T2DNA 的转移) , 细胞内源激素水平(影响细胞的生长, 分化) , 细胞壁的结构(影响细菌的吸附) 等有关。

来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏感性，进而产生不同的转化效果。

Schlappi 和Hohn用农杆菌感染3 个玉米品系不同发育时期的幼胚时发现, 幼胚中分生组织尚未分化时, 农杆菌不能侵染; 当幼胚开始分化第1～ 2 小叶时, 侵染率为7%～ 32%; 授粉后14～ 16 D 的幼胚, 侵染率为32%～ 73%。

总的来说, 分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感. 从组织培养的角度讲, 所选的外植体必须具有较高的再生能力。

用农杆菌转化单子叶植物, 应选择处于适宜生理状态的那些组织, 其特点是: 能够产生vir 基因活化分子；内源激素浓度适宜；农杆菌比较容易附着于细胞壁上；细胞分裂旺盛,DNA 大量合成, 有利于T-DNA 的摄入和整合。

3.培养方法
转化所用的组培不同于纯粹的组织培养方法。

农杆菌介导的转化要经过几个步骤:外植体接种农杆菌、与农杆菌共培。

外植体在含抑制农杆菌及筛选转化体的药剂的培养基上培养,要受到农杆菌和药剂的胁迫。

因此为保证转化细胞的生长,必须: ①合理掌握接菌的数量、时间和共培的时间,注意解决瞬时表达效率高及随后而来的细菌增殖所导致的外植体不能生长的矛盾。

有些植物外植体生长易受农杆菌侵染后的抑制,还有些嫩的外植体经农杆菌侵染后不能生长。

②根据不同的植物材料选择不同的再生系统。

在基因转化中,一个很重要的环节是抑制农杆菌生长,防止细菌过度生长而产生污染. 为了解决这个难题,在培养基中经常添加对植物细胞无毒害作用的抑菌性抗生素(如头孢霉素、羧苄霉素) . 这类抗生素即能有效地抑制细菌的生长,又不影响植物的正常生长,同时能够有效地提高转化效率以及快
速获得转基因植物. ③采用预培的方法以减轻伤害胁迫,调整细胞状态。

预培养还有可能减少伤害胁迫而有利于农杆菌的感染。

④采用化学药剂缓解胁迫对外植体生长的抑制。

硝酸银是抑制乙烯生成的抑制剂,具有促进形态发生的功能,在油菜转化的培养基中加入较高浓度的硝酸银(70～90 nmol/L) 能提高再生频率, 在对黄瓜的再生和转化实验中, 植物材料进行预培养, 并在培养基内添加2 mg/L 的硝酸银也可提高其再生率和转化率，实验表明这是在选择条件下获得转化体的必要条件。

在葡萄的转化中,旺盛生长的胚性愈伤组织在接种农杆菌后,生长受抑制,组织褐化以至细胞死亡,据测试,这是细胞的过氧化造成的. 后来有人用抗氧化剂DTT(dithiothreitol) 和PVPP(polyvinypolypyrrolidone) , 可使被侵染的细胞恢复生长,有高达63 %的外植体能产生胚状体,进而获得转化株。

4.再生植株的细胞起源
农杆菌介导的转化方法主要作用于外植体表层细胞, 所以只有再生植株的细胞起源于表层才能顺利获得转化植株, 否则转化效率较低, 转化株表现为嵌合体。

为避免嵌合体的产生，选择受体最好不用分生组织或分生细胞预先存在的材料如茎尖、胚芽、顶芽、腋芽等。

只有处于转化感受态和再生感受态的细胞才有可能被转化并形成转基因植株, 高效的微繁殖组织培养体系不一定适用于植物转化。

因此, 在进行转化前, 对再生植株的细胞起源需有明确的了解, 以免出现“再生”和“转化”的矛盾。

5. 不同选择药物对转化效率的影响
由于在植物基因转化中,外源基因稳定的整合频率低,故如何选择适当的筛选标记,以准确、有效地分离转化与非转化细胞,且不干扰细胞的正常生长,也不干扰再生植株的产生,是转化成功的重要环节之一。

第二题：实验设计如下：
一、实验原理
选取该有毒植物的有效杀虫部位，选择适宜的条件,使实验材料中的毒蛋白在提取过程中不会因变性而降低其毒性。

采用了在冰水浴中,用磷酸盐的缓冲溶液,并通过调整缓冲之比来调节pH 值,将蛋白质从材料中抽提出来，再经过脱盐、上层析柱对各组分进行分离、纯化，对实验各步骤得到的蛋白质溶液进行杀虫实验检测,根据检测结果判定该植物的有效杀虫成分。

二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：该有毒植物的有效杀虫部位
（二）仪器设备：紫外分光光度计、蛋白监控仪、离心机、凝胶柱、垂直电泳槽、振荡器、透析袋、研钵。

（三）试剂：石油醚、磷酸盐缓冲溶液(PBS , 内含9 g/ L 的NaCl , pH 7. 2)、硫酸铵、洗脱液。

三、实验步骤
（一）蛋白组分的提取及分离
提取过程在4 ℃下进行。

1、实验材料的预处理
如实验材料为植物幼嫩茎叶，先将材料洗净，剪成小块或片，再加提取液研磨。

如材料是种子，应先将种子去皮、研磨，石油醚脱脂后再加提取液提取。

2、提取液提取
将预处理好的材料加入磷酸盐的缓冲溶液(并加入少量的巯基乙醇,以防止蛋白质变
性) ,然后置于震荡仪中震荡6h ,抽提得到蛋白质提取液(全过程在冰水浴中进行) 。

3、硫酸铵沉淀
向提取液中不断加入硫酸铵，使浓度分别为60%、70%、80%，将各步所得沉淀分别溶于少量蒸馏水。

4、透析
将各步所得溶液装入透析袋，扎紧袋口，对蒸馏水透析。

5、上柱分离
将透析得到的各溶液分别上柱进行洗脱分离，洗脱馏分在蛋白监控仪280 nm 波长监控 , 分别收集各峰样品。

（二）杀虫实验
将新鲜青菜叶切成小块,置于分离得到的各溶液中浸泡15h 后（也可直接将分离所得溶液喷在青菜叶上）,取出放于烧杯中,将鳞翅目幼虫放在菜叶上；作为对比,在另一烧杯中放入未
浸泡（或喷洒）溶液的新鲜青菜叶,观察幼虫死亡情况。

（三）杀虫有效成分的确定
1、根据检测结果判定有毒成分所在样品。

2、在垂直电泳槽上电泳该样品，看组分是否单一，初步确定该有毒蛋白的性质。

3、对有毒成分进一步纯化，以研究其理化、生物特性。

第三题：
提高植物光能利用率
（一）光能利用率
植物光能利用率一般为1% ：落到叶面100%，其中反射了10—15%，透过5%，吸收了80—85%，这其中参加光合作用0.5—3.5%，蒸腾损失76.5—84.5%，这样一般植物的最终光能利用率约为1%。

光能利用率不高的原因，主要有以下几方面： 1.光合作用对光谱选择吸收：400—700纳米可见光可能被吸收；2.漏光损失；3.反射、透射损失：叶片上角质，中蜡质茸毛等反射掉一部分光；叶片透过去一部分； 4.光饱和现象限制：CO2同化速度小于光反应速度。

（二）提高光能利用率的途径
提高光合速率降低呼吸消耗，目前主要研究工作集中在以下三方面。

1、改善参与光合的关键酶
光合用在效率在很大程度上依赖于RubisCO酶的活性，但是，这个酶催化的反应速度很
慢，且该酶的活性受氧气的抑制。

利用其他生物高活性的RubisCO基因替代植物的这个基因，理论上会使植物的光合效率提高。

澳大利亚科学家利用一个细菌的单亚基RubisCO基因替换烟草叶绿体基因组的RubisCO大亚基基因，转基因植物虽能进行光合作用，但未能使光合效率提高。

日本科学家把一个氰细菌的果糖景天庚酮糖双磷酸酶基因转入烟草的叶绿体基因组中，提高了光合作用效率，较对照高20%。

2、将C4类植物的光合基因转入C3类植物中
世界上95%植物属于C3型，这类植物的光合作用受氧气抑制，并且通过光呼吸丢失二氧化碳分子。

而C4植物增加了细胞中的二氧化碳浓度，所以它的光合作用效率高。

因此，可以把C4植物参与光合作用的基因转移到C3植物中，可能会改善C3植物的生物合成。

常用是将C4植物玉米的PEPC酶基因转入C3植物水稻，虽然水稻中PEPC酶活性提高了2-3倍，光合作用受氧抑制减轻，但光合速率未能大幅提高。

3、增加叶绿体数量
植物的光合作用发生在叶绿体中，因此提高叶片细胞中叶绿体的数量也有可能提高光合作用效率。

有研究将参与叶绿体的分裂或形态发生的基因超量表达，但并没有使叶绿体的数量增加。

这发面的进展有可能给植物分子育种开辟一条新路。

从以上可看出，虽然目前将植物的光能利用率提高1%还不能实现，但相信随着生物技术的不断发展，各种植物生长条件的不断优化，这一目标是能够实现的。