第十五章基因重组与基因工程
合集下载
基因重组与基因工程概述
拼接重组体（见Leabharlann 型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源 双链区的两侧来自不同亲本DNA。
5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´ 拼 接
重
组
5´ 3´
体
三、位点特异性重组
位点特异性重组：由整合酶催化，在两个 DNA位点特异的短序列之间发生的切割和连 接反应: 噬菌体DNA整合
细菌特异位点重组
（二）细菌的特异位点重组
H片段
(a) hix
hix
DNA P hin P
h2
阻遏基因rh1
启动序列
h1
hin mRNA H2与阻遏基因mRNA
Hin重组酶
H2鞭毛素 阻遏蛋白
(b)
H片段倒位
P hin P h2
阻遏基因rh1
h1
hin mRNA
H1 mRNA
Hin重组酶
H1鞭毛素
沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变
Holliday Junction (A) The structure of a Holliday junction bound by Cre recombinase (gray), a bacteriophage protein. (B) A schematic view of a Holliday junction.
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´
DNA 5´ 连接酶 3´
5´
3´ 5´
Holliday模型同源重组步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链
基因重组和基因工程
5´
3´
5´ 3´
5´3´
5´ 拼 接
重
组
体
3´ 5´
3´ 内切酶
5´
(ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´ 5´
DNA
连接酶
3´ 5´
3´ 5´
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移 至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合 作用(conjugation)。
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在 供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基 因重组即为转导作用(transduction)。
例 λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway)
溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
①两个同源染色体DNA排列整齐
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA对应的链连接，形成Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
5´
3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
第十五章基因重组与基因工程
19
四、转座重组
由插入序列和转座子介导的基因移位 或重排称转座。
转座子：是指一个或一组基因从一个位置
移到另一位置，这些移动的基因称为转座子。
20
（一）插入序列转座
插入序列的组成：
反向重复序列：9~41bp，位于两侧 转座酶编码基因：产物引起转座，位于中为插入序列所特有。
25
转座子与插入序列区别：
相同点：均是以两个反向重复序列为侧翼 序列，并含有转座酶基因； 不同点：转座子含有抗生素抗性等有用的 基因。
26
第二节 重组DNA技术
1865年，Gregor Mendel的豌豆杂交实验； 1944年，O. T .Avery等的肺炎球菌转化实验； 1973年，美国斯坦福大学的科学家构建第一个 DNA重组分子。 1980年，开始建造第一家应用重组DNA技术生产 胰岛素的工厂。 1997年，英国罗斯林研究所成功克隆了“多莉”
（三）转导作用 病毒二次感染时，发生在供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重组。 病毒 感染 细胞（供体）
整合、切离
带供体（部分）DNA的病毒
二次感染
细胞（受体）与供体DNA转移、重组
15
（三）转导作用
噬菌体
感染
溶菌
感染
重组
细菌
整合：外来DNA与宿主DNA重组，成为 宿主DNA的一部分。
16
21
插入序列转座 保守性转座：插入序列从原位移至新位 复制性转座：插入序列复制后，一个复制本 移至新位，另一个留在原位。
插入序列的复制性转座（P351，图14-7）
22
插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
23
（二）转座子转座
转座子组成： 反向重复序列 转座酶编码基因 特殊基因：如抗生素抗性基因等
高一生物必修课件基因重组和基因工程及其应用
基因重组和基因工程都可以用来创造新的 生物性状或改良生物品种。
两者区别
9字
基因重组是自然发生的，而 基因工程是人工操作的。
9字
基因重组的结果具有不确定 性，而基因工程可以精确设 计和控制。
9字
基因重组通常发生在同一物 种内，而基因工程可以跨物 种进行。
9字
基因重组不需要额外的工具 或技术，而基因工程需要依 赖特定的工具和技术，如限 制性内切酶、DNA连接酶等 。
高一生物必修课件基因重组和 基因工程及其应用
汇报人：XX
20XX-01-13
CONTENTS
• 基因重组 • 基因工程 • 基因工程应用 • 基因重组与基因工程关系 • 实验：基因重组和基因工程操
作实践
01
基因重组
基因重组概念
基因重组定义
基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组 合。
05
实验：基因重组和基因工程操作实践
实验目的与原理
目的
通过实验操作，了解基因重组和基因工程的基本原理，掌握相关实验技能，培养科学探究精神和实验能力。
原理
基因重组是生物体内基因重新组合的过程，包括同源重组和非同源重组两种方式。基因工程则是通过人工手段对 基因进行改造和重组，实现特定性状或功能的表达。本实验将通过模拟基因重组和基因工程操作，加深对相关原 理的理解。
重组DNA分子的导入
目的基因的检测与鉴定
将重组DNA分子导入受体细胞，使目的基 因在受体细胞中表达。
通过PCR、Southern杂交等方法检测目的 基因是否成功导入并表达。
03
基因工程应用
农业生产应用
转基因作物
通过基因工程手段，将外 源基因导入农作物中，使 其获得抗虫、抗病、抗除 草剂等优良性状，提高作
两者区别
9字
基因重组是自然发生的，而 基因工程是人工操作的。
9字
基因重组的结果具有不确定 性，而基因工程可以精确设 计和控制。
9字
基因重组通常发生在同一物 种内，而基因工程可以跨物 种进行。
9字
基因重组不需要额外的工具 或技术，而基因工程需要依 赖特定的工具和技术，如限 制性内切酶、DNA连接酶等 。
高一生物必修课件基因重组和 基因工程及其应用
汇报人：XX
20XX-01-13
CONTENTS
• 基因重组 • 基因工程 • 基因工程应用 • 基因重组与基因工程关系 • 实验：基因重组和基因工程操
作实践
01
基因重组
基因重组概念
基因重组定义
基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组 合。
05
实验：基因重组和基因工程操作实践
实验目的与原理
目的
通过实验操作，了解基因重组和基因工程的基本原理，掌握相关实验技能，培养科学探究精神和实验能力。
原理
基因重组是生物体内基因重新组合的过程，包括同源重组和非同源重组两种方式。基因工程则是通过人工手段对 基因进行改造和重组，实现特定性状或功能的表达。本实验将通过模拟基因重组和基因工程操作，加深对相关原 理的理解。
重组DNA分子的导入
目的基因的检测与鉴定
将重组DNA分子导入受体细胞，使目的基 因在受体细胞中表达。
通过PCR、Southern杂交等方法检测目的 基因是否成功导入并表达。
03
基因工程应用
农业生产应用
转基因作物
通过基因工程手段，将外 源基因导入农作物中，使 其获得抗虫、抗病、抗除 草剂等优良性状，提高作
(生物学)基因重组和基因工程PPT课件
（一） DNA克隆
克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
Clone: A population of identical cells or DNA molecules descended from a single progenitor. Also viruses or organisms that are genetically identical and descended from a single progenitor.
recombination that occurs only at specific
sequences depending on an enzyme-mediated
recognition. 3) Transposition recombination is
the movement of a gene or a set of genes from
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。是最基 本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Homologous recombination （ 同 源 重 组 ） : Recombination between two DNA molecules of similar
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering
目录
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
DNA重组
同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)
克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
Clone: A population of identical cells or DNA molecules descended from a single progenitor. Also viruses or organisms that are genetically identical and descended from a single progenitor.
recombination that occurs only at specific
sequences depending on an enzyme-mediated
recognition. 3) Transposition recombination is
the movement of a gene or a set of genes from
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。是最基 本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Homologous recombination （ 同 源 重 组 ） : Recombination between two DNA molecules of similar
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering
目录
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
DNA重组
同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)
基因重组和基因工程课件
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞
62
63
64
65
66
67
68
69
70
（六）克隆基因的表达 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
1
DNA重组包括：
同源重组
接合作用
细菌的基因转移与重组 转化作用
位点特异重组
转导作用
转座重组
2
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和 再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单 链或双链片段的交换。
DNA Recombination Technique
24
基因工程诞生的历史背景：
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
医学分子生物学——基因重组与基因工程
医学分子生物学名词解释——基因重组与基因工程1、同源重组：发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
2、转化作用：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。
3、转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
4结合作用：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
5位点特异重组：是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。
6转座：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。
7、DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA。
8、基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
10、载体：克隆载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。
9、表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
10、同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。
15、配伍末端：有些限制性内切酶虽然识别序列完全相同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端，称为配伍末端，可进行相互连接。
基因重组与基因工程
三、逆转录酶
特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： ⑴ ⑵ 以单链RNA 为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。
⑶
逆转录酶的应用：
⑴ ⑵
；
⑶
产生平(头末)端/钝端
5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5'
Sma I
5'-CCC + GGG-3' 3'-GGG CCC-5'
其它特殊性质
同裂酶（异源同工酶） 同尾酶 可变酶
的Ⅱ型限制酶
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的 识别序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生 平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末 端，称为同识异切。
㈠
DNA聚合酶Ⅰ
E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有
3 种酶活性的多功能性酶。
包括：
5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
DNA pol Ⅰ应用
⑴ 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； 第二条cDNA链的合成；
⑵
⑶
Escherichia coli RY13 大肠杆菌 Haemophilus influenzae 流感嗜血菌 Providencia stuartii 164 普罗威登细菌 Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌
BamHⅠ Bgl Ⅱ
EcoRⅠ Hind Ⅲ PstⅠ SalⅠ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•
方法：
•
直接法
抗药性标志选择
•
标志补救
•Leabharlann 分子杂交法•非直接法 免疫化学法
•
酶联免疫检测法
2020/5/24
• （六）、克隆基因的表达
重组DNA技术目的 ：
获得大量目的基因
基本目的
目的基因表达（蛋白质表达） 医药应用
蛋白表达体系 表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离、纯化
意义：合成有药用价值的蛋白或多肽
•
物性状改变的过程。
•
方式：自动获取外源DNA 基因重组（自然）
•
人为供给外源DNA 基因工程
•
例：细菌抗药性
• 3．转导：以病毒为媒介、将供体菌的DNA片段转移到
•
受体菌基因组的过程。
•
例：噬菌体感染宿主菌
•
2020/5/24
• 4．转座：指可移动的DNA序列（游动基因）
•
从基因组的 一处移动到另一处
2. 整合。
序列的特异位点间发生的
•
2.同源重组(基本重组)
•
定义：发生在同源序列间的重组。
•
(依赖DNA间同源性，不是特异性)
•
机制：
•
a.产生中间体
• 2020/5/24
b.分解中间体
第二节 基因工程（重组DNA技术 ）
• 一、定义：指在体外用人工（酶学）的方法，
•
将目的基因与载体DNA重组，
• 特征：
• 常用：
质粒DNA :pBR323
•
噬菌体DNA:pUC19
•
粘粒
•
病毒DNA
•
YAC( 酵母人工染色体载体 )
2020/5/24
• 过程:
四、基本原理
分、选（切）、接、转、筛、表。
• 1．分离目的基因。（目的基因的获取）
• 2．选择与构建基因载体。
•
(切割目的基因和载体基因，便白的基因
•
4.PCR
•
dNTP
目的基因
•
酶、引物、模板
2020/5/24
• （二）、克隆载体的选择和构建
•
a. 常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA
。
•
b. 目的基因离开染色体不能复制，
•
需在载体 (染色体）才能复制。
•
c. 根据操作基因的性质、目的
•
对载体和目的基因进行切割。
•
排列组合的现象。
• 二、意义：基因变种、物种演变、进化的基础
• 三、方式： 接合
•
转化
•
转导
•
转座
2020/5/24
• 1．接合:指供体细胞（细菌）和受体细胞（细菌）
•
接触，使DNA从一个细胞转移到另一个细胞
•
的过程。
•.
例:较大质粒在细菌间的转移
• 2．转化：指外源DNA被引入细胞，导致其遗传和生
2020/5/24
• （三）、外源基因与载体的连接
•
原理：
•
目的基因+载体
重组DNA分子
•
DNA连接酶
•
方式：
•
粘性末端 自然 同一酶切点的连接
•
（主）
不同酶切点的连接
•
人工 同聚物加尾连接
•
人工接头连接
•
平头连接
相同或不同酶切后连接
2020/5/24
• （四）、重组体DNA导入受体菌
• 方式： 转化
三、基本要素
•
酶
•
目的基因
•
载体基因
•
宿主
2020/5/24
（一）、工具酶
限制性核酸内切酶
•
定义：识别DNA的特异序列,并在识别
•
位点或其周围切割DNA双链的
•
一类内切酶.
•
分类：I、II（常用）、III类
•
命名
•
II类酶 特点 识别点是DNA回文结构
•
切割方式
•
粘性末端 5’粘端
•
3’粘端
•
平头末端
第十五章 基因重组与基因工程
• 思路： • • •
座
定义 基因重组 意义 （自然） 方式：接合、转化、转导、转
• 基因重组
类型
• • • • •
2020/5/24
•
基因工程 （人工）
定义 意义 基本要素 原理 临床
第一节 自然界的基因转移和重组
• 一、定义：
• 基因重组：指细胞基因组中DNA顺序重新
基本程序
• 1.选择治疗性基因（目的基因）
• 2.选择基因载体
• 3.选择靶细胞（受体细胞）
PCR:指在反应体系中加入模板、dNTP、
引物、DDRP和缓冲液；经多次（25-30） 变性、退火、延伸循环反应；使目 基因扩增（指数增长）的过程。
2020/5/24
• （三)基因载体
• 定义：为携带目的基因、实现无性繁殖或表达
•
成有意义的蛋白质而采用的DNA分子。
• 作 用：携带目的基因进入受体细胞。
•
的过程。
•
游动基因 介导形式 保守性转座
•
复制性转座
•
种类
插入序列
•
转座子
•
a.插入序列：转座酶基因＋反向重复序列
•
b. 转座子
•
定义：可从染色体一个位点转移到
•
另一位点的分散的重复序列。
• ）
2020/5/24
结构：插入序列＋特殊序列（e.g:抗性基因
四、类型
1. 位点特异重组:由整合酶催化，在两个DNA
•
配伍末端 识别点不同，
• 2020/5/24
末端相同
（二）、目的基因 定义：是指所要研究或应用的基因。
类型：cDNA（互补DNA） 基因组DNA
来源: ①化学R
（聚合酶链反应）
2020/5/24
方式：原核表达体系
真核表达体系
2020/5/24
五、临床
• 1.诊断
• a. DNA诊断
• b. DNA诊断的应用
•
产前诊断
•
携带者诊断
•
症状前诊断
•
预防 易感性诊断
•
器官移植组织配型
•
法医
2.治疗
a. DNA治疗（基因治疗）
•
e.g:间接体内体细胞基因治疗（ex vivo）
• b. 2020/5/24 生物制药
• 3．连接目的基因与载体。
• 4．重组DNA转入受体菌（细胞）。
• 5．筛选重组体。（含目的基因的受体菌或细胞） 。
• 6．目的基因的表达。
e.g: 2020/5/24
质粒为载体进行DNA克隆
• （一）、目的基因的获取
•
途经 1.化学合成法。
•
DNA合成仪•2.基因组DNA中筛选。•限制性内切酶
•
转染
•
感染
• 受体菌条件：安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态
过程：无性繁殖。
•
重组DNA导入受体菌，随受体菌生长、
•
繁殖，重组DNA分子得以复制、 扩增的
• 2020/5/24
过程。
• （五）、重组体的筛选
•
筛选（选择）：将培养基中众多的转化
•
菌落（菌斑）分开，并鉴定
•
出带有目的基因的菌落的过程。
•
并把重组体DNA导入宿主细胞，
•
使目的基因扩增和表达的技术。
• 也称：重组DNA、重组DNA工艺学、
•
DNA克隆、基因克隆、重组DNA技术。
• 克隆（clone）：指由同一个始祖经过无性繁
•
殖所形成的副本或拷贝集合。
• 克隆化 2020/5/24 ：获得同一拷贝的过程。
二、意义 扩增基因、生产蛋白、创造新种