分子荧光光谱法
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分子荧光分析法实验讲义
5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样
架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测
3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”
图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。
若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开
关，开启电脑。预热仪器20分钟。
2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0,
4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性，以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是，一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量，并从激发态到低能量的稳定态跃迁，从而释放出某种光，而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中，激发态是将能量投射到分子上，使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态，然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁，跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言，当激发态的分子能量超过一定的最低能量时，它将进入具有较低能量的稳定态，从而释放出光子。
通常说，这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质，它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物，也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题，可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应，也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点，可用于大量的物质的有效分析。
此外，它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而，分子荧光光谱法也有一些缺点，比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质，而且只有在激发态跃迁释放出荧光时，它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术，它具有敏锐的测量特性，可以快速、准确地测量多种物质，因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此，它的测量过程还简单易行，使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。
当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。
当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。
这种发光现象被称为荧光。
荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。
通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。
荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。
因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。
在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。
荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。
通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。
从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。
荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。
在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。
从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。
荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。
荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。
荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。
分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。
例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。
在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。
此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。
总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。
不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。
分子荧光光谱法剖析
达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的
最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出
的光线称为磷光。
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以
磷光的波长比荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测
到。因此磷光很少应用于分析。
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
S1
能 量
T1
发
发
射
7
275~345
5
290~380
0
平面刚性构造效应
可降低分子振动，削减与溶剂的相互
作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相像
构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
〔2〕 荧光量子产率Φ
物质分子放射荧光的力量用荧光量子产率〔Φ〕 表示：
发射荧光的分 发子 射数 的光子数 Φ= 激发态的分=吸 子收 数的光子数
单重态： 一个分子中全部电子自旋都配对的电 子状态。
三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状 态。激发三重态能量较激发单重态低。
大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且 自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所 以大多数分子在基态时处于单重态。
当分子受光照射时，假设光子能量恰好等于分子的 某两个能级的能量之差，则分子吸取光子并从基态 跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能 级。但其自旋方向不会马上转变，分子仍处于单重 态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转， 生成三重态。
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
荧光是指一种光致发光 的冷发光现象。当某种 常温物质经某种波长的 入射光〔通常是紫外线〕 照射，吸取光能后进入 激发态，并且马上退激 发并发出比入射光的的 波长长的出射光〔通常
分子荧光光谱法原理和仪器
分子荧光光谱法原理和仪 器
分子荧光光谱法是一种分析化学方法，通过观察和测量分子在激发光作用下 发出的荧光来研究分子结构和性质。
了解分子荧光光谱法的原理和仪器有助于我们更好地理解其应用领域和实验 操作。
荧光分子和激发过程
荧光分子是能够吸能量并将其转化为发射荧光的分子。激发过程包括吸收光、激发态、发光和退激态。
通过深入了解荧光光谱法的原理和仪器，我们可以更好地理解其在实验中的 应用和限制。
吸收光
荧光分子通过吸收光子的能量，使得电子从基 态跃迁到高能级的激发态。
激发态
激发态是荧光分子处于高能级的状态，此时分 子能够进行振动或旋转。
发光
当激发态的荧光分子退回到基态时，它们会通 过发射光子的方式释放掉多余的能量。
退激态
退激态是荧光分子回到基态的过程，荧光的强 度和寿命取决于其退激速率。
荧光光谱仪的主要结构
荧光光谱仪由光源系统、内部光路、检测系统和计算机控制组成。
光源系统
提供激发光源，常见的光源包括氙灯、氙气甚至激 光。
内部光路
引导激发光、荧光光和散射光以及其他传感器的光 线。
检测系统
用于测量发出的荧光光的光子数量，并将其转化为
计算机控制
用于采集和处理光谱数据，并进行分析和解释。
荧光光谱法的应用领域
材料科学
用于研究材料的荧光性质，如半导体材料的能 带结构。
环境监测
检测水质、大气污染物和土壤污染物。
生物医学
用于分析生物分子、蛋白质和细胞的结构、功 能和相互作用。
食品安全
用于检测食品中的污染物、添加剂和营养成分。
总结与展望
分子荧光光谱法是一种强大的研究工具，能够提供丰富的信息和数据。随着 技术的发展，我们可以期待其在更广泛的领域得到应用。
分子荧光光谱法是一种分析化学方法，通过观察和测量分子在激发光作用下 发出的荧光来研究分子结构和性质。
了解分子荧光光谱法的原理和仪器有助于我们更好地理解其应用领域和实验 操作。
荧光分子和激发过程
荧光分子是能够吸能量并将其转化为发射荧光的分子。激发过程包括吸收光、激发态、发光和退激态。
通过深入了解荧光光谱法的原理和仪器，我们可以更好地理解其在实验中的 应用和限制。
吸收光
荧光分子通过吸收光子的能量，使得电子从基 态跃迁到高能级的激发态。
激发态
激发态是荧光分子处于高能级的状态，此时分 子能够进行振动或旋转。
发光
当激发态的荧光分子退回到基态时，它们会通 过发射光子的方式释放掉多余的能量。
退激态
退激态是荧光分子回到基态的过程，荧光的强 度和寿命取决于其退激速率。
荧光光谱仪的主要结构
荧光光谱仪由光源系统、内部光路、检测系统和计算机控制组成。
光源系统
提供激发光源，常见的光源包括氙灯、氙气甚至激 光。
内部光路
引导激发光、荧光光和散射光以及其他传感器的光 线。
检测系统
用于测量发出的荧光光的光子数量，并将其转化为
计算机控制
用于采集和处理光谱数据，并进行分析和解释。
荧光光谱法的应用领域
材料科学
用于研究材料的荧光性质，如半导体材料的能 带结构。
环境监测
检测水质、大气污染物和土壤污染物。
生物医学
用于分析生物分子、蛋白质和细胞的结构、功 能和相互作用。
食品安全
用于检测食品中的污染物、添加剂和营养成分。
总结与展望
分子荧光光谱法是一种强大的研究工具，能够提供丰富的信息和数据。随着 技术的发展，我们可以期待其在更广泛的领域得到应用。
分子荧光光谱法
（1）荧光与结构的关系
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的 的速率常数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最 常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的 脂肪族化合物也可能产生荧光 取代基效应： 苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而 给电子基会使荧光增强。
（2）环境因素 ①温度 温度对荧光的影响很大。 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率， 因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶 液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%， 当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。 ②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧 光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷 状态，从而使其荧光发生变化。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素 自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光 谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在 通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐 射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光 度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I） I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
（3）跃迁的方式：
①无辐射跃迁： 振动弛豫、内转换、系间窜越、外转换 ②辐射跃迁： 荧光、磷光
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光致发光（Photoluminescence）: 荧光和
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
☆内部转换(Inter-nal Conversion)
☆体系间跨越跃迁
去活化过程
1. 激发 2. 去活化过程
荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与荧光物质的吸光强度Ia及其荧光物质的荧光效率 φ成正比。
1. 荧光强度与浓度的关系
F = φIa
其中 Ia = I0—I
的围比量
分 子 不 发 荧 光 。
不 如 吸 收 光 谱 法 广
光 多 的 物 理 参 数
少 和 方 法 简 便
，
★ 子为选 不能择 一产性 定生比 发紫吸 射外收 荧可光 光见谱 或吸法 磷收好 光的。 ；分因
★
谱灵
法敏
低度
高
个 数 量 级 ；
。 检 测 限 比 吸
收
光
荧光光谱法基本原理
分子的激பைடு நூலகம்与失活
I0——入射光辐射功率；
I——透射光辐射功率；
Ф——荧光效率（荧光量子产率）
荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关
kf
k f ki kec kic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程 （系间窜越、外转换、内转换）
的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则F=ΦI0（1-10-εbc)=φI0(1-e-2.303εbc) 又因
e-2.303εbc=1-2.303 εbc-(-2.303 εbc)2/2!-(-2.303 εbc)3/3!
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配 对的分子的电子状态。大多数有 机物分子的基态是单重态。当基 态一对电子中的一个被激发到较 高能级，其自旋方向不会立刻改 变，分子仍处于单重态。 三重态 有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其 吸光度超过0.05时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离.
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
☆内部转换(Inter-nal Conversion)
☆体系间跨越跃迁
去活化过程
1. 激发 2. 去活化过程
荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与荧光物质的吸光强度Ia及其荧光物质的荧光效率 φ成正比。
1. 荧光强度与浓度的关系
F = φIa
其中 Ia = I0—I
的围比量
分 子 不 发 荧 光 。
不 如 吸 收 光 谱 法 广
光 多 的 物 理 参 数
少 和 方 法 简 便
，
★ 子为选 不能择 一产性 定生比 发紫吸 射外收 荧可光 光见谱 或吸法 磷收好 光的。 ；分因
★
谱灵
法敏
低度
高
个 数 量 级 ；
。 检 测 限 比 吸
收
光
荧光光谱法基本原理
分子的激பைடு நூலகம்与失活
I0——入射光辐射功率；
I——透射光辐射功率；
Ф——荧光效率（荧光量子产率）
荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关
kf
k f ki kec kic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程 （系间窜越、外转换、内转换）
的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则F=ΦI0（1-10-εbc)=φI0(1-e-2.303εbc) 又因
e-2.303εbc=1-2.303 εbc-(-2.303 εbc)2/2!-(-2.303 εbc)3/3!
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配 对的分子的电子状态。大多数有 机物分子的基态是单重态。当基 态一对电子中的一个被激发到较 高能级，其自旋方向不会立刻改 变，分子仍处于单重态。 三重态 有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其 吸光度超过0.05时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离.