分子荧光分析
分子荧光分析
2 共扼效应 因为: 共扼程度越大, * 与之间的能级差越小,就越利于基态电子 被激发. 所以大多数能产生荧光的物质都具有共扼结构，如芳环等.
0.18
0.61
荧 光 效 率 增 大
0.93
3 刚性平面结构: 可以减小面外振动,减小与溶剂或其他溶质的 相互作用.减小能量以非光能方式损失.
HO OH
分子荧光分析
1. 发射光谱分析
样品池 + 光源
1
2. 吸收光谱分析
2
样品池
1
1
第一节 基本原理
一、分子荧光的产生 先知道分子能级的单重态和多重态 能级的多重度 M = 2S + 1 (S为自旋量子数代数和) 同轨道上的一对电子：
自旋方向相反S = 0, M=1表示能级为单重态 (S);
自旋方向相同S = 1, M=3表示能级为三重态 (T)。
HO
O
OH
O O
O O
酚酞
荧 光 素
4 取代基效应: 接在苯环上的给电子基团使处于基态的电子数 增多,电子跃迁的几率增大, 使荧光增强.
五荧光物质的浓度与荧光强度的关系 ——定量分析理论依据
荧光效率
=发射荧光量子数/吸收光量子数
不是所有被激发的分子都可以发射荧光，能发射荧 光的实际分子数相对于被激发分子的总数之比叫荧光效 率。
荧光效率决定荧光强度If
=Ia =Io -It =Io （1-e-ε lc）
Io: 激发光强度
If =2.3Iolc =Kc
荧光强度If与激发光强度和溶液浓度成正比，此关 系只有在极稀溶液条件下才成立.
六、荧光猝灭
荧光分子与溶剂分子或其他分子相互 作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝 灭。 包括： 碰撞猝灭，能量转移等。
分子荧光法测定实验报告
一、实验目的1. 熟悉分子荧光法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握荧光光谱仪的使用方法。
3. 通过实验，测定罗丹明B的荧光光谱，分析其激发光谱和发射光谱。
4. 掌握荧光定量分析的方法。
二、实验原理分子荧光法是一种灵敏的定量分析方法，基于物质在特定波长范围内吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态，再回到基态时释放出一定波长的荧光。
罗丹明B作为一种荧光物质，在特定波长范围内具有明显的荧光特性。
通过测定罗丹明B的激发光谱和发射光谱，可以确定其最佳激发波长和发射波长，从而进行定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、无水乙醇、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：准确移取一定量的罗丹明B标准溶液，用无水乙醇稀释至100mL，配制成一定浓度的罗丹明B标准溶液。
2. 测定激发光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，扫描激发光谱，记录激发波长范围内荧光强度的变化。
3. 测定发射光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，以激发光谱中最大激发波长为激发波长，扫描发射光谱，记录发射波长范围内荧光强度的变化。
4. 荧光定量分析：取一定量的罗丹明B样品溶液，按照上述步骤测定其激发光谱和发射光谱，计算样品溶液中罗丹明B的浓度。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择540nm作为激发波长。
2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择590nm作为发射波长。
3. 荧光定量分析：根据罗丹明B的激发光谱和发射光谱，以及标准曲线，计算样品溶液中罗丹明B的浓度为1.2×10^-5 mol/L。
第1节分子荧光分析原理
第1节分子荧光分析原理
分子荧光分析是一种基于光谱学的分析技术，用于检测其中一种物质的含量，它的原理是将吸收的光转换成可见的发射光，并通过检测发射光的强度来测定该物质的含量。
分子荧光分析的基本原理是，物质在紫外光的照射下，由其原子中的电子进行内部能量转换，当原子中的电子进行能量转换时，物质会释放可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含的物质的量。
分子荧光分析的技术基础是分子的能级构型。
分子的能级构型指的是一种构型，它包含一种特殊的分子电子构型，其中电子能量的分布形式是一种动态的状态，它可以在受到激发条件时发生变化，从而由原子中的一种状态转变成另一种状态。
分子荧光分析技术利用一种叫做“荧光”的物理现象，荧光是指在紫外光的照射下，物质由其原子中的电子发射出可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含物质的量。
分子荧光分析的优点有：灵敏度高，发射光强度与激发光强度之间的比值可以高达数万倍；分辨率高，可以检测低于ppb水平的分子；壁效应低，不受外界环境的影响；灵活性高，可以检测多种物质类型；可以进行在线监测；成本低廉，可以实现连续和定期的检测工作。
总结起来，荧光分析原理是：将紫外光照射到试样中。
分子荧光分析法
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。
当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。
当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。
这种发光现象被称为荧光。
荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。
通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。
荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。
因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。
在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。
荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。
通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。
从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。
荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。
在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。
从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。
荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。
荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。
荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。
分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。
例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。
在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。
此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。
总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。
不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
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30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分子荧光分析法实验
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
10-6 ~ 10-2 s
F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光 强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若 固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发 光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的 曲线，称为激发光谱。
1.2 荧光光谱
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架 内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零 时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
7.未知试样的测定：
将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标 准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
定性分析：φf；λex；λem；峰形等
其它（略）
分子相互作用研究；
显微成像（物理迁移与化学衍化的原位 “显迹”）
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C 高端生化研究： 代谢动力学跟踪；
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特殊溶剂效应 溶剂与荧光物质间的特殊作用
问题问1题.41什.3 么什因么素化影合响物化能合产物生的分荧子光荧强光度？？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生 三、荧光和分子结构的关系
p→p*跃迁、共轭体系 刚性平面结构 供电子取代基
四、溶液的荧光强度
荧光溶液的吸光度≤0.05
激的形子电动激振叠级子动处低荧射态基到振态发产激剂相从减发振式，子能发动由失能能于振光光的态激动的射生发或互而弱态动传从能层态能较活级层激动分子过分发驰最光荧态其作使甚分能递而级。分层高到的。发能子返程子态豫低子光分它用荧至子量给失的子间电较较态层，回。吸，失振返或子溶和光消将以周活较通的子低高最的发基收通活动回磷将质能或失过热围到低过重能电振电过到能基光通分量磷的剩的分该振磁内层态。第过子交光过波转一，，与间换强程换跃激然从溶的，度。和迁发后而，
问题1.1 什么是分子荧光？
第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
激发能量 样品样品来自lI激发光致发光
激发能量 分子发光
发射 定性 定量
分子发光的分类
电磁波 荧光、磷光
化学能 化学发光
生物能 生物发光
分子发光分析的特点
灵敏度高、选择性好
问题1.2 分子荧光是如何产生的？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
1. 荧光强度与溶液浓度的关系 I f 2.3 f I0lc Kc
2. 影响荧光强度的因素
a. 溶剂影响 b. 温度影响 低温荧光
温度升高，荧光减弱
荧光分子内部振动 荧光分子与其它分子间的碰撞
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生 三、荧光和分子结构的关系
p→p*跃迁、共轭体系 刚性平面结构 供电子取代基
四、溶液的荧光强度
荧光溶液的吸光度≤0.05
1. 荧光强度与溶液浓度的关系 I f 2.3 f I0lc Kc
2. 影响荧光强度的因素
a. 溶剂影响 一般溶剂效应 介电常数、折射率
b. 共轭效应 共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。
0.07
0.93
0.27
0.18
问题1.3 什么化合物能产生分子荧光？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生
三、荧光和分子结构的关系
1. 分子荧光产生的必备条件
吸收激发光 一定的荧光量子效率
2. 分子荧光与分子结构的关系
a. 跃迁类型 p→p*跃迁荧光效率较高。
S0
激发
发射
激发光去除后荧光立即消失，磷光不会立即消失。
问题1.2 分子荧光是如何产生的？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光 二、荧光和磷光的产生
荧光波长(光谱)与 激发光波长无关
基态分子吸收电磁波跃迁到激发态，通过内转换和振动驰 豫失活到第一单重(三重)激发态的最低振动能层，然后， 发射光子返回基态，从而产生荧光(磷光)。
第三章 分子荧光分析法
Chapter 3 Molecular Fluorescence
本章学习应该关注的几个问题
问题一 分子荧光是如何产生的？
问题二 分子荧光是如何测量的？
问题三 分子荧光法如何进行定性和定量分析？
问题一 分子荧光是如何产生的？
问题1.1 什么是分子荧光？ 问题1.2 分子荧光是如何产生的？ 问题1.3 什么化合物能产生分子荧光？ 问题1.4 什么因素影响化合物的荧光强度？
I0
Ia I0 It I0 (1 e2.3cl )
I f f I0 (1 e2.3cl ) e2.3cl 1 2.3cl (2.3cl)2 (2.3cl)3
2!
3!
若 lc 0.05 e2.3cl 1 2.3cl
问题问1题.41什.3 么什因么素化影合响物化能合产物生的分荧子光荧强光度？？ 第一节 基本原理
b. 共轭效应 共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。
c. 刚性平面结构 减少分子振动，降低碰撞去活可能性。
d. 取代基效应 供电子基团：增强；吸电子基团：减弱。
重原子效应：荧光减弱、磷光增强。
F 0.16
Cl 0.05
Br 0.01
I0
问题问1题.41什.3 么什因么素化影合响物化能合产物生的分荧子光荧强光度？？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光 二、荧光和磷光的产生 三、荧光和分子结构的关系 四、溶液的荧光强度
p→p*跃迁、共轭体系 刚性平面结构 供电子取代基
1. 荧光强度与溶液浓度的关系
荧光溶液的吸光度≤0.05
I f 2.3 f I0lc Kc 荧光定量分析基本关系式
I f f Ia A log It cl It I0 10 cl I0 e2.3cl
与激发态分子失活过程的速率常数有关
f
kf
kf
ki
问题1.3 什么化合物能产生分子荧光？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生
三、荧光和分子结构的关系
1. 分子荧光产生的必备条件
吸收激发光 一定的荧光量子效率
2. 分子荧光与分子结构的关系
a. 跃迁类型 p→p*跃迁荧光效率较高。
紫外-可见光：分子荧光或磷光
化合物分子吸收能量从基态电子能级跃迁至激发态，若 其返回基态时释放出电磁辐射，则产生分子发光。
问题1.2 分子荧光是如何产生的？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生
1. 分子的激发 激发单重态、激发三重态 S2
2.激发态分子的去活化与荧光
S1
a. 振动驰豫 b. 内转换 c. 荧光(磷光)发射 d. 外转换
问题1.3 什么化合物能产生分子荧光？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生
三、荧光和分子结构的关系
1. 分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光
分子必须具有一定的荧光量子产率
f
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光强度(I f ) 吸收的光强度(Ia
)
荧光量子产率：
荧光分子发射 的光量子数与 吸收的光量子 数之比。
b. 共轭效应 共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。
c. 刚性平面结构
0.18
≈1
问题1.3 什么化合物能产生分子荧光？ 第一节 基本原理
一、分子发光与分子荧光
二、荧光和磷光的产生
三、荧光和分子结构的关系
1. 分子荧光产生的必备条件
吸收激发光 一定的荧光量子效率
2. 分子荧光与分子结构的关系
a. 跃迁类型 p→p*跃迁荧光效率较高。