管柱层析法
利用柱层析的方法分离和提纯有机物
注意事项
1.加入氧化铝时动作要缓慢，使之均匀加 入，以防在柱中间流下气泡。若已有气 泡则拍打层析柱。 2.氧化铝平面上要保持一定液面。 3. 收集到亚甲基兰之前收集的乙醇可反复 使用。
实验五
柱层析
有机化学与药物化学教研室
柱层析
将固定相装于柱管内构成层析柱， 层析过程在层析柱内进行。按层析柱的 粗细差别，可分为填充柱层析法、毛细
管柱层析法及微填充柱层析法等。
一、实验目的
1. 掌握柱层析的原理和基本操作。 2. 利用柱层析的方法分离和提纯有机物。
二、实验原理
柱色谱是利用混合物中各组分受吸 附作用的不同以及各组分在溶剂中溶解 度的差别，将各组分分离。可分为吸附 柱层析和分配柱层析。
2、加样
在色谱柱表面小心加入亚甲基兰和甲
基橙的混合溶液5-8滴（注意勿使样品沾 在色谱柱的内壁上）。
3、洗脱
打开活塞，使样品液全部进入吸附剂（勿使流 干）。加入无水乙醇，打开活塞使蓝色谱带完全进 入吸附剂，关闭活塞；重复二次，蓝色谱带逐渐下 移。继续加无水乙醇，使亚甲基蓝完全洗脱，收集 于第1个三角锥瓶。改用蒸馏水作洗脱剂（操作步骤 与以无水乙醇作洗脱剂相同），使甲基橙完全洗脱， 收集于第2个三角锥瓶。滴加盐酸溶液可发现变红。
（[1] 称取110mg甲基橙和550mg亚甲基蓝于250ml 95%乙醇中 溶 解。）
四、实验步骤
1、装柱
取清洁干燥的色谱柱，管底垫少许棉花，防止 氧化铝漏下。倾入无水乙醇20ml，称取15g柱用氧 化铝，经漏斗缓慢倒入管中，同时轻轻拍打色谱 柱，用无水乙醇清洗沾在管内壁上的氧化铝。打 开活塞，氧化铝随着溶剂流动继续下沉，直至沉 降停止。在氧化铝表面平整紧贴地覆盖一张略小 于色谱柱内径的滤纸，打开活塞使氧化铝表面仅 留一薄层约1mm的溶剂。
层析柱原理和使用方法
层析柱原理和使用方法
层析柱原理是一种常用的色谱技术，可以分离复杂混合物中的各个组分。
层析柱是一个长管状结构，内部填充有吸附剂或离子交换树脂等材料。
根据组分在填料中的亲和性差异，不同组分会以不同的速度通过填料，从而实现分离。
层析柱的使用方法如下：
1. 样品预处理：将混合物中的目标组分溶解或悬浮于合适的溶剂中，并进行必要的样品处理（如pH调整、过滤等）。
2. 建立实验条件：选择合适的填料材料、填料粒径和填充方法，并确定适当的溶剂体系和流动相条件。
3. 装填填料：将选择好的填料装入柱中。
填料的打包密度和均匀性对色谱分离效果有重要影响，因此要确保填料的均匀性和紧密度。
4. 平衡柱：用流动相预浸柱，使填料均匀吸附流动相，并达到平衡状态。
平衡时间根据填料种类和样品性质而定。
5. 注射样品：将样品以适当的体积注射到柱中，并控制注射速度和压力。
6. 运行分析：启动流动相，控制流动相速度和温度，使样品组分逐渐分离，并记录结果。
7. 数据分析：根据检测器的信号，对分离出的目标组分进行定性和定量分析。
层析柱的使用注意事项：
1. 填料选择：根据被分离组分的性质选择合适的填料。
2. 流动相选择：要确保流动相对目标组分具有足够的分离能力。
3. 注射量控制：注射量应根据柱容量和检测器灵敏度进行合理
控制。
4. 柱温控制：柱温对于某些温度敏感性样品的分离效果有重要影响，可以根据需要进行柱温控制。
5. 柱保养：正确使用和保养层析柱，避免杂质吸附和填料破碎等情况的发生。
6. 数据分析：及时记录和分析实验结果，确保实验数据的准确性和可靠性。
亲和层析管柱
亲和层析管柱亲和层析管柱的原理是利用具有构象特异性结构的配体，使其与目标生物大分子发生特异性结合。
在层析柱中，固定有配体的填料可以吸附目标生物分子，并随后通过适当的洗脱缓冲液来洗脱目标生物分子。
因此，亲和层析管柱方法不仅可以实现目标生物分子的纯化，还可以实现目标生物分子的富集。
亲和层析管柱的优势之一是其高专一性和选择性。
由于配体与目标生物分子之间具有特异性结合，因此可以实现目标生物分子的选择性吸附和纯化。
与传统的分离技术相比，亲和层析管柱可以将目标生物分子从混合物中高效地分离出来，从而避免了非特异性结合和混杂物的干扰。
另一个优势是亲和层析管柱具有较高的纯度和回收率。
由于配体与目标生物分子之间的特异性结合，目标生物分子可以以高纯度的形式被洗脱出来。
此外，亲和层析管柱还可以实现目标生物分子的高效富集和回收，从而提高了目标生物分子的使用率和产量。
在实际应用中，亲和层析管柱广泛应用于生物医药领域、生物化学研究领域和生物制药工业。
通过亲和层析管柱方法，可以对多种生物大分子进行纯化和富集，例如蛋白质、抗体、酶、核酸等。
与传统的离子交换层析、凝胶过滤层析相比，亲和层析管柱具有更高的分离效率和纯度，可满足不同生物实验和生产的需要。
在实际操作中，亲和层析管柱的选择取决于目标生物分子的性质和配体的特异性。
通常情况下，选择合适的配体是亲和层析的关键。
目前，市面上已经有多种经典的亲和配体，如Ni-NTA（镍离子-IDA）、GST（谷胱甘肽-S转移酶）、His-Tag（组氨酸标签）等，用于纯化目标生物分子。
总的来说，亲和层析管柱是一种重要的生物分离技术，广泛应用于生命科学领域和生物制药工业。
其高特异性、高效率和高纯度的特点使其成为生物大分子纯化和富集的首选方法。
随着技术的不断发展和完善，亲和层析管柱将继续发挥重要作用，推动生物医药领域和生物科学研究的发展。
柱层析的分离原理和分离步骤
柱层析的分离原理和分离步骤：
柱层析是一种广泛应用于化学和生物学领域中的分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在固定相和流动相之间进行不同的分配和移动速度，从而达到分离的目的。
在柱层析中，固定相通常是由不溶性基质形成，如硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺等，而流动相则是由溶剂组成。
样品被加到柱子上后，用流动相洗脱，在洗脱过程中，样品中的各组分根据其在固定相和流动相中的分配系数不同，经历多次反复的吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，最终实现分离。
柱层析的操作方式主要包括常压分离、减压分离和加压分离，其中，常压分离是最简单的分离模式，适用于大于50-100g的产品，但洗脱时间较长；减压分离可以节省填料的使用量，但由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，且有时易分解的化合物难以得到；加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间。
柱层析方法和技巧
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
一：柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
二：关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
柱层析法的原理和方法ppt课件
实验案例讨论与经验分享
案例介绍
介绍几个典型的柱层析法应用案例，包括实验设 计、操作过程、结果分析等。
经验分享
分享实验过程中积累的操作技巧、注意事项、故 障排除等方面的经验。
互动交流
鼓励与会者提问、分享自己的实验经验和心得， 进行深入的讨论和交流。
总结与展望
06
柱层析法原理与方法的总结回顾
柱层析法原理
方法 调整流动相的组成和pH值
优化柱温和流速
参数优化的方法和原则
• 选择合适的色谱柱和填料
参数优化的方法和原则
原则 通过实验确定最佳参数组合
根据目标物质的性质和分离要求进行参数优化 注意避免参数变化过大，以免对分离效果造成不利影响
结果分析方法和技术
方法 峰面积和峰高比较法
标准曲线法
结果分析方法和技术
离、纯化和鉴定。
生物样品分析
柱层析法可用于生物样品中痕量 物质的分离和分析，如生物碱、 氨基酸等，提高分析的灵敏度和
准确性。
柱层析法在食品安全检测中的应用实例
01
农药残留检测
柱层析法可用于食品中农药残留的分离和检测，通过合适的填料和洗脱
条件，将农药与食品中的其他成分分离，提高检测的准确性和可靠性。
发展历程
自20世纪初开始，柱层析法逐渐从基础的实验室技术发展为高效、自动化的现 代分离分析方法。
柱层析法的重要性和应用
重要性
柱层析法在化学、生物、医药、环境等领域发挥着重要作用 ，为复杂混合物的分离和纯化提供了有效手段。
应用
药物研发、天然产物提取、环境监测、食品安全等领域广泛 应用柱层析法。
柱层析法的基本原理
实验操作和案例分
05
析
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
柱层层析法
柱层层析法1. 什么是柱层层析法柱层层析法（Column Chromatography）是一种分离和纯化化合物的常用技术。
它基于化合物在固定相（柱层）和移动相（溶剂）之间的不同亲和性，通过不同程度的分配来实现分离。
2. 柱层层析法的原理柱层层析法的原理基于化合物在柱层中的分配行为。
柱层通常由多孔性固体填充而成，填充物可以是硅胶、氧化铝或其他吸附剂。
移动相则是溶剂，可以是单一溶剂或溶剂混合物。
当样品溶液经过柱层时，不同的化合物会因其与固定相的亲和性不同而以不同速度移动。
较亲和固定相的化合物会被较牢固地吸附在柱层上，而较亲和移动相的化合物则会更快地通过柱层。
这样，化合物就会在柱层中被分离开来。
3. 柱层层析法的步骤柱层层析法通常包括以下步骤：3.1. 准备柱层首先，选择合适的柱层填充物，并将其装填到柱层中。
填充物的选择应根据化合物的性质和需求进行，常用的填充物有硅胶和氧化铝。
3.2. 平衡柱层将柱层与移动相进行平衡，使填充物充分吸附溶剂。
3.3. 样品加载将待分离的化合物样品溶液加载到柱层的顶部。
注意，样品溶液应预先与移动相进行适当的预处理和溶解。
3.4. 洗脱化合物通过逐步改变移动相的组成或使用不同的移动相，将化合物从柱层中洗脱出来。
洗脱时应注意控制溶剂流速和溶剂比例，以保证化合物的有效分离和纯化。
3.5. 收集洗脱液将洗脱液收集起来，通常使用试管或收集瓶。
根据需要，可以将收集的洗脱液进行进一步处理和分析。
4. 柱层层析法的应用柱层层析法广泛应用于化学、生物化学和制药领域。
它可以用于分离和纯化天然产物、合成化合物、蛋白质和核酸等多种化合物。
4.1. 天然产物的提取与纯化柱层层析法可以用于从天然产物中提取和纯化目标化合物。
通过合理选择填充物和移动相，可以实现对复杂混合物中目标化合物的高效分离和纯化。
4.2. 合成化合物的纯化柱层层析法也常用于合成化合物的纯化。
通过柱层层析，可以将化学反应的产物与副产物分离开来，从而获得纯度较高的目标化合物。
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管柱層析法
一、實驗目的：
了解薄膜層析法TLC、管柱層析法CC的應用及其操作
二、實驗原理：
（1）自層析法問世八十多年來，層析法已成為分離化合物最有利的工具。
除了提供成千上萬的有機化合物的分離之外，還提供了定性鑑定及定量分析的數據。
與傳統的分離純化方法（蒸餾、再結晶、萃取、昇華等）相比，層析法具有微量、快速、簡便、安全及高效率等優點。
（2）層析法可分為三大類：吸附層析法、分配層析法及離子交換層析法。
依其操作不同，可分為氣相層析法（Gas chromatography）及液相層析法（Liquid chromatography）。
其中氣相層析法因牽涉到儀器分析，在有機化學實驗中並不予討論，我們僅僅討論液相層析法。
（3）液相層析法又可分為薄膜層析法TLC（Thin Layer Chromatography）、管柱層析法CC（Column Chromatography）、濾紙層析法PC（Paper Chromatography）及高效率液相層析法HPLC（High Performance Liquid Chromatography）。
1、薄膜層析法TLC：
薄膜層析法屬於吸附層析的一種。
由於混合物中的各個組成份對固定相（Stationary phase）的吸附能力不同，當移動相（沖堤液，Mobil phase）流經固定相時，便會發生無數次的吸附和解吸，吸附力弱的的組成份隨流動相迅速向前移動，吸附力強的組成份滯留在後，由於各組成份具有不同的移動速率，最後得以在固定相上分離。
這一過程可表示為：化合物在固定相化合物在流動相。
平衡常數K的大小取決於化合物吸附能力的強弱。
一個化合物愈強烈地被固定相吸附，K值愈低，則這個化合物沿著流動相移動的
紫外燈顯色：如果樣品本身是發螢光的物質，可以將TLC片放置紫外光下照射，則化合物會吸收紫外光而呈現黑點。
碘薰顯色：把碘的結晶放在廣口瓶內，放入TLC片，蓋上瓶蓋，直至暗棕色的斑點明顯出現後取出，用筆畫下記號。
這種方法是利用有機化合物與碘形成分子錯合物（烷及鹵化烷除外）而帶有顏色。
(5)TLC的特點：
靈敏度高（10-6~10-4g）、快速、簡易、價錢低廉、安全。
(6)TLC的用途：
決定混合物中化合物的個數。
鑑定兩種或以上的化合物是否為同一物。
監控反應進行的程度。
確定純化的效果
決定管柱層析法的沖提液極性比例。
2、管柱層析法（CC）：
管柱層析法一般可區分為乾填法及濕填法。
(1)乾填管柱法：
將一空的管柱（column）填滿吸附劑（矽膠或二氧化矽），再將要分離的物質放在柱頂，使溶劑藉毛細作用和地心引力向下移動而將色層展開。
展開完畢，將吸附劑從柱內移出，將已分離的的各組成份分層帶用適當溶劑分離出來，分別處理。
(2)濕填層析法：
將一空的管柱（column）填入吸附劑（矽膠或二氧化矽），再將要分離的物質放在柱頂，加入沖提液沖堤向下移動而將各個組成份沖
堤下來，分別加以收集後，除去沖提液，便達到分離的效果了！
目前較常使用為濕填層析法。
濕填層析法屬於吸附層析法，原理類似於薄層層析法，欲分離的混合物中的各組成
份分配在固定相和移動相之間，化合物被固定相
吸附愈強，該化合物存在於流動相中就愈少，沿
沖提液移動的距離就愈小。
藉著沖堤作用及吸附劑同時對溶劑及溶質
吸附力大小而使之成為差別移動，進而將混合物
中各組成分離。
管柱層析法作用類似多次萃取，
其萃取次數與管柱高度成正比，利用混合物中各
組成份在固定相及移動相不同的吸附力（萃取中
的分配係數）而分離。
一般極性大的的物質被吸附較多，而極性較小的物質因不易被吸附，因此較易向
下流動。
因此較易向下流動
下流動
管柱層析除了在使用器材與薄層層析法不同之外，其最大的差異乃在於管柱層析法所處理的量遠大於薄層層析法，約以克來計算。
因為層析管柱填充的吸附劑的量遠大於TLC片，且管柱的大小、長短可以依欲分離的物質量的多少而選擇，因而管柱層析法可用於分離比較大量的物質，而TLC分離的量比較小，約為毫克以下。
3、濾紙層析法：
濾紙層析法主要用於多官能基團或高極性化合物如醣、氨基酸等的分離，作為支持物的濾紙是由高純度的的纖維素製造，纖維素是高分子量的多烴基化合物。
濾紙層析法的原理較為複雜，主要是分配過程，固定相是存在濾紙中的水，流動相是事前被飽和的溶劑。
與薄層層析法一樣，用毛細管點樣，由於濾紙的毛細作用，溶劑在濾紙上緩緩上升，樣點中的各個成份由於移動速率不同，在隨溶劑上升的過程中得到分離。
如果各組成份具有顏色，可以直接觀察。
若不具顏色，
則可利用TLC顯色的方法使之顯色。
三、實驗步驟：
1、管柱層析法（CC）：
(1)充填－packing（濕填）：
1取一乾淨管柱先測試是否會漏水（測試完畢之後，務必烘乾後再使用），加入少許棉花以防止矽膠外漏。
2取100毫升燒杯倒入適量矽膠加入正己烷（比例約1:10）均勻混合，不斷攪拌並緩慢倒入管柱中。
3倒入的過程中，不斷敲打管壁，使矽膠堆積密實，同時打開下端旋轉閥，使正己烷持續滴下。
4當上方正己烷接近矽膠約1公分時，關閉旋轉閥。
(2)附著－coating：
1欲分離的混合物若是固體以最少量的溶劑加以溶解；若是液體則加以濃縮來提高濃度。
2打開旋轉閥讓正己烷繼續滴下，直至正己烷達矽膠上端（愈接近愈好但不可讓矽膠乾掉），關閉旋轉閥。
3沿著管壁將混合物加入（不可直接倒入，以免矽膠出現凹洞），打開旋轉閥讓混合物進入矽膠層，直至混合物達矽膠上端（愈接近愈好但不可讓矽膠乾掉），關閉旋轉閥。
(3)沖堤－elution：
將沖堤液－正己烷加入管柱內，打開旋轉閥讓沖堤液滴下，開始收
集。
沖堤液的極性改變由小到大。
(4)收集－collection：
先收集黃色液體－二茂鐵，待以正己烷沖堤下的
黃色液體完全收集完畢，則更改沖堤液－二氯甲
烷，繼續沖提收集5毫升。
六、注意事項：
1、CC
1管柱內不可有水，以防止出現斷層
2充填矽膠的量約為管柱高度的一半
2、TLC
1滴點不可浸入液面
2每次沖堤液皆須重新配
3TLC沖堤液與管柱層析比例不同
4TLC板平行放入液面
3、勿直視紫外光燈。
4、廢液處理：
1含正己烷之沖提液可倒入”不含鹵素有機廢液桶”。
2含二氯甲烷之沖提液必須倒入”含鹵素有機廢液桶”。
七、實驗問題：
1、若毛細管點在TLC上點半徑過大會有何種現象發生？
2、為何需在TLC上下各劃一條線？
3、跑片槽內放置一張濾紙的意義何在？
4、為何TLC滴點不可浸入液面？
5、為何每次沖堤液皆須重新配？
6、進行CC充填時為何不可讓管柱乾掉？
管柱層析法
實驗報告
學系：姓名：學號：組別：日期：
數據及結果：
1、TLC：
沖堤液名稱結構式用量極性比較
2、C.C：
化合物名稱結構式顏色使用之沖堤液R f值計算A：
B：
A: B:。