八种常用生化实验步骤
生化反应鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解生化反应在微生物鉴定中的重要性。
2. 掌握常见生化反应的原理和方法。
3. 通过实验，对给定的微生物进行鉴定。
二、实验原理生化反应是指微生物在生长过程中，通过酶的催化作用，将营养物质转化为自身所需的物质，同时产生一些代谢产物。
这些代谢产物可以用来鉴定微生物的种类。
常见的生化反应包括糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验等。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌等。
- 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂等。
- 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等。
- 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等。
2. 仪器：- 酒精灯- 接种环- 超净工作台- 恒温培养箱- 高压灭菌锅- 试管- 移液枪- 滴管四、实验方法1. 菌种培养：将菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
2. 糖发酵试验：- 将培养好的菌种接种于糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖），置于恒温培养箱中培养24小时。
- 观察培养基颜色变化，记录发酵结果。
3. 吲哚试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入吲哚试剂，观察颜色变化，记录结果。
4. 甲基红试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入甲基红试剂，观察颜色变化，记录结果。
五、实验结果与分析1. 糖发酵试验：- 大肠杆菌：发酵葡萄糖、乳糖，不发酵蔗糖。
- 金黄色葡萄球菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 枯草芽孢杆菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 变形杆菌：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
2. 吲哚试验：- 大肠杆菌：吲哚试验阳性。
- 金黄色葡萄球菌：吲哚试验阴性。
- 枯草芽孢杆菌：吲哚试验阴性。
- 变形杆菌：吲哚试验阳性。
初中化学实验步骤说明
初中化学实验步骤说明化学实验是初中阶段学生重要的学科内容之一。
通过实践操作，学生能够更深入地理解化学理论知识，并培养实验操作能力。
下面我将详细说明初中化学实验的步骤。
一、实验名称：酸碱中性试验1. 实验目的：通过观察试剂的颜色变化来判断其酸、碱、中性的性质。
2. 实验器材：试管、试管夹、打滴管、石蕊、酚酞溶液、酚酞指示剂、苯酚酚酚、硫酸、氢氧化钠溶液、盐酸溶液。
3. 实验步骤：a. 将试管架放在实验台上，并将试管夹夹在试管夹上；b. 用打滴管分别取少量氢氧化钠溶液和盐酸溶液滴入不同的试管中；c. 加入酚酞指示剂，观察颜色变化，记录下实验结果；d. 用另一个试管重复以上步骤，将氢氧化钠溶液和苯酚酚酚溶液进行酸碱中性试验。
4. 实验结果：氢氧化钠溶液在酚酞指示剂的作用下变成粉红色，为碱性；盐酸溶液在酚酞指示剂的作用下变成无色，为酸性。
二、实验名称：金属活动性实验1. 实验目的：了解金属的活动性顺序，并观察金属在溶液中的反应。
2. 实验器材：试管、试管夹、金属样品（铜、铁、锌）、铜(Ⅱ)硫酸溶液、铁(Ⅱ)硫酸溶液、锌硫酸溶液。
3. 实验步骤：a. 将试管架放在实验台上，并将试管夹夹在试管夹上；b. 依次在三个试管中加入铜(Ⅱ)硫酸、铁(Ⅱ)硫酸、锌硫酸溶液；c. 将铜条放入第一个试管中，观察其反应产物；d. 依次将铁条、锌条放入其他试管中，观察其反应产物。
4. 实验结果：铜条放入铜(Ⅱ)硫酸溶液中无反应，铁条放入铁(Ⅱ)硫酸溶液中起化学反应，锌条放入锌硫酸溶液中起化学反应。
通过以上实验步骤说明，学生能够更具体地了解初中化学实验的操作方法，加深对化学反应原理的理解。
希望学生们在实践中不断提升实验技能，培养科学思维和实验精神。
愿每位学生在未来的学习和实验中都能取得更好的成绩！。
生化的操作规程
生化的操作规程
《生化操作规程》
一、实验目的
本实验室生化操作规程的目的是为了规范化实验室的生化实验操作，保障实验室工作人员和实验的安全，同时确保实验结果的准确性和可靠性。
二、实验室安全规定
1. 实验室内严禁吸烟、禁止饮食及饮水；
2. 实验操作前需穿戴好实验服、手套等个人防护装备；
3. 实验操作后及时清洗双手，避免污染实验台面和设备。
三、实验操作流程
1. 实验操作前需对实验室内的设备和试剂进行检查，确保设备完好且试剂标签清晰明确；
2. 操作时需按照实验操作流程一步步进行，不得随意更改实验方案或步骤；
3. 操作过程中要注意实验室卫生，确保操作台面及时清洁；
4. 实验完成后，将所有使用的试剂及设备清理整理妥当。
四、废弃物处理
1. 实验过程中产生的废弃物应按照实验室废弃物分类规定投放相应的垃圾桶中；
2. 不得将化学试剂废液随意倾倒，应按照实验室废液处理规定进行处理。
五、突发事件处理
1. 在实验操作过程中如发生任何突发事件或不明情况，应立即停止操作并向实验室负责人或实验室安全管理人员报告；
2. 在突发事件后，应及时进行安全评估和事故处理，确保实验室秩序和工作人员安全。
六、实验室清洁
1. 实验室日常清洁工作应定期进行，确保实验室环境卫生；
2. 遵守实验室垃圾分类处理规定，将实验室产生的废弃物及时清理并投放到指定的垃圾桶中。
通过以上实验室生化操作规程的制定和执行，可以有效规范实验室内的生化实验操作，提高实验室工作人员的安全意识和操作规范化水平，确保实验结果的准确性和可靠性。
常见的生物化学实验方法
常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。
本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。
一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。
常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。
在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。
例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。
二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。
常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。
在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。
例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。
三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。
常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。
在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。
例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。
四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。
常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。
在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。
例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。
生化操作规程
生化操作规程
《生化操作规程》
生化操作规程是指在生物实验室中进行生化实验时所需遵守的一系列操作规定。
这些规定旨在保护实验者的安全，确保实验的准确性和可重复性，同时降低实验中可能发生的危险。
生化操作规程通常包括以下几个方面的内容：
1. 实验室安全规定：生化实验室是一个充满潜在危险的场所，因此实验者必须严格遵守安全规定，包括佩戴实验服和防护眼镜、正确使用实验室设备等。
2. 生物样品处理：生化实验通常需要处理生物样品，包括细胞、组织、血液等。
在处理这些样品时，实验者必须注意避免污染和交叉感染，确保实验的可靠性。
3. 试剂使用和储存：生化实验需要使用各种试剂和溶液，实验者必须严格按照规定的配制方法和使用方法进行操作，并妥善储存这些化学品，避免误用和意外事故。
4. 废弃物处理：生化实验产生的废弃物包括实验用品、生物样品、化学试剂等，这些废弃物必须按照规定的程序进行处理，避免对环境造成污染和危害。
5. 实验记录和数据保存：生化实验过程中产生的数据必须进行准确记录，并且按照规定的程序进行保存。
这些数据对于科学研究和实验结果的验证至关重要。
总之，生化操作规程是生物实验室中一个必不可少的部分，它为实验者提供了必要的操作指南和安全保障，确保了生化实验的顺利进行和实验结果的可靠性。
对于所有从事生化实验的人员来说，遵守生化操作规程是一项基本的责任和义务。
实验五-细菌鉴定中常见的生理生化反应
实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应一、实验目的。
1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。
2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。
3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理。
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。
以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。
1.糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。
指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。
产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。
2.甲基红试验（M.R试验）甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。
有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。
3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验）伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。
某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。
4.靛基质试验某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。
5.硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。
6.明胶液化实验明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。
微生物生理生化反应实验报告
微生物的生理生化反应一、实验目的1.掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的测定方法。
2.了解细菌代谢类型的多样性。
3.了解细菌生长现象及代谢产物在鉴别中的意义。
4.学习接种技术。
二、实验原理在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。
1.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。
产酸后再加入溴甲酚紫指示剂后会使溶液呈黄色，且杜氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且杜氏小管中无气体。
2.甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。
大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
3.伏-普试验（VP）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成非酸性或中性末端产物，某些细菌产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被氧化成二乙酰，二乙酰与胍基作用，生成红色化合物，为阳性。
4.靛基质（吲哚）试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5.硫化氢实验：某些细菌分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫酸铵亚铁等铁盐可与硫化氢反应生成不溶性硫化亚铁之黑色沉淀，为硫化氢实验阳性。
微生物检验中常用的生化反应
微生物检验中常用的生化反应各种细菌所具有的酶系统各不相同，对养分物质的利用力量各异，因而在代谢过程中所产生的合成或分解产物也不同。
应用生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌的种、属鉴定。
这种利用生化方法来鉴别细菌的试验，统称为细菌的生化试验或生化反应，是识别细菌的重要方法之一。
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有：(一)糖酵解试验各种微生物因含有不同的分解糖(醇、苷)类的酶，所以分解糖类的力量各不相同，而且分解相应糖类后形成的终末产物亦随细菌种类而异，有的产酸，有的还可以产生气体，因此可作为鉴别细菌的依据，对肠道杆菌的鉴别尤为常见。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培育物少许，接种于发酵液体培育基鲁，若为半固体培育基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36℃ 1.0 ℃培育，每天观看结果，检视培育基颜色有无转变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培育基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培育物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵力量，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫、溴百里蓝和An-drade指示剂。
(二)淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：以18h~24h的纯培育物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培育物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36℃ 1 ℃培育24 h ~48 h,或于20℃培育5d。
然后将碘试剂直接滴浸于培育基表面，若为液体培育物，则加数滴碘试剂于试管中。
马上检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培育基呈深蓝色、菌落或培育物四周消失无色透亮环、或肉汤颜色无变化。
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实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。
7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。
学习PCR反应的基本原理和基本技术。
了解引物设计的一般要求。
二、材料和试剂10Х扩增缓冲液4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0）Tap DNA 聚合酶5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）模板DNA琼脂糖凝胶PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管一、实验操作1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合：10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl3端引物1μlD D W16.25μld N T P2.5μlT a q酶0.25μl 模板 1μl2）按照以下方法进行PCR扩增：循环数预变性变性复性聚合后延伸35个循环 95 ℃ 5min 94℃ 1min 63℃ 1min 72℃ 1min 72℃ 10min 聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。
3）抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果，用DNA marker 来判断扩增片段的大小。
凝胶一般用Goldview 染色后观察扩增的量与片段大小。
从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。
二、对可能发生PCR过程中主要疑难问题的解析表2.1 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法现象可能原因补救措施扩增的目的条带试剂不合格；PCR仪有故障；在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行较弱或不能检测扩增程序有错误； PCR，比较扩增产物结果。
到相应的条带。
复性条件不是最合适的。
重新计算引物Tm，必要时优化引物浓度。
若是引物问题，要重新合成引物。
被复性结合到模板上的优化MgCl2、模板DNA、和dNTP的浓度；引物不适合延伸。
重新纯化模板DNA以除去抑制物；在恒定复性温度下增加PCR循环数。
变性不完全。
增加变性时间或设置更调质变性温度。
两个引物之间的距离太大。
应用那些能够扩增大的DNA片段的热稳定的DNA聚合酶。
多种扩增产物条带优化MgCl2、模板DNA、热稳定性DNA聚合酶和dNTP的浓度。
用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上割取取目的条带作模板重新进行PCR扩增。
引物二聚体过量应用降落PCR；重新设计合成引物，特别注意引物3末端的序列。
实验二、碱裂解法大量提取质粒DNA及检测三、实验目的与原理简介质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。
质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。
②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等）。
④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。
在强碱性pH时，染色体线性DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二．试剂及步骤试剂配制：SolⅠ： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I)，高压灭菌，4°保存。
SolⅡ：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。
或者每100ml：SDS 1g，NaOH 0.8g，加DDW定容至100ml。
不要剧烈搅拌！SolⅢ：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。
高压灭菌，4°保存。
STE buffer： 1M Tris-HCl （pH8.0）1ml， 0.5 M EDTA 0.2 ml,Nacl 0.5844g,DDW 98.8ml。
高压灭菌！70%乙醇 10ml5M LiCl 20ml3M醋酸钠，pH5.2酚/氯仿/异戊醇无菌水DDW13％(W/V)PEG8000，1.6M NaCl:6.5g PEG,4.6752g NaCl,加水定容至50ml,过滤除菌.(仅由第一组配制)按1/100的比例接种保存的pPIC9K大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数生长期)。
将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37℃、250rpm剧烈震荡培养过夜。
⒈离心管（50mL）分装菌液，离心去上清（10000rpm，5min，4℃）；重悬于15mL（原始菌液的1/4体积）STE中，离心去上清（10000rpm，1-2min，4℃）离心结束尽可能吸干上清液。
⒉重悬于2mL 冰冷的SolⅠ中；剧烈震荡重悬菌体。
⒊加入4mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min。
⒋加入3mL冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min。
⒌4℃，10000rpm离心10min。
⒍脱脂棉过滤收集上清至新的离心管，加等体积异丙醇，混匀沉淀核酸，室温放置大于10min。
⒎室温，10000rpm离心15min，小心弃去上清，收集核算沉淀；将离心管倒置纸巾上以除去残余的上清。
⒏少许70％乙醇清洗管壁及沉淀，室温挥发（一般室温放置10-15min足够）；⒐加3mL 预冷DDW溶解核算沉淀。
⒑加等体积预冷5M LiCl，混匀，于4°C ，10000rpm离心10min，取上清至新的离心管。
（沉淀大分子RNA及蛋白）⒒加等体积异丙醇，混匀沉淀核算，离心去上清（12000rpm，15min，室温）。
⒓小心倒去上清，倒置管口，使液体溜干。
少许70％乙醇清洗管壁及沉淀，室温挥发。
⒔用490µL DDW溶解核酸沉淀，将溶液转移至1.5 mL离心管中，加入RNaes A至终浓度20µg/mL，37℃反应45min。
⒕加500µL [13％(W/V)PEG8000，1.6M NaCl]，混匀静置，4℃沉淀3-4h。
⒖最大转速（12000rpm）离心20min，回收DNA沉淀；沉淀用500µL 70％乙醇重悬以除去微量PEG，高速离心5min以回收核酸；吸取乙醇，重复一次，室温挥发乙醇。
⒗500µL DDW溶解DNA，用等体积的酚，酚/氯仿/异戊醇，25:24:1；氯仿/异戊醇24:1各抽提一次；每次振荡摇匀，高速离心10min。
（抽提过程中要小心，不要吸到有机相）⒘收集最后水相至新的离心管，加1/10V的[3M醋酸钠，pH5.2]，混匀；用2倍体积的无水乙醇沉淀，低温(-20℃)放置>20min。
⒙高速冷冻离心10min，去上清。
⒚预冷70％乙醇洗涤沉淀；高速冷冻离心10min ；取上清，挥发乙醇；50µL DDW溶解质粒。
实验三、酶切与连接一、实验目的与原理简介限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。
制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带：而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面：1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接方式；5）接头状态。
酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同一DNA片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因的克隆。
用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。
进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。