滤膜过滤法
微生物限度-薄膜过滤法
微生物限度(薄膜过滤法)
1、用到的设备和仪器:
微生物限度仪,一次性过滤杯,无菌滤膜(0.45um,Φ50mm)酒精灯,电子打火消毒喷枪,不锈钢镊子、无菌均质袋(无菌锥形瓶)、不锈钢剪刀、电子天平
2、环境要求:C+A检验前先开紫外灯和空调净化系统半小时。
3、样品外包装在准备室用75%乙醇或0.1%的新洁尔灭溶液浸泡10秒钟,然后通过传递窗传到检测室超净工作台内
4、供试液制备:在超净工作台内,用无菌剪刀打开外包装,根据样品稀释要求,称取适量供试品,加入稀释液。
(一般称取10g样品,加入90ml胰酪大豆胨液体培养基中)
5、过滤:先用消毒枪对过滤头消毒,然后用无菌镊子把无菌滤膜贴这绿色面朝上贴在过滤头上,在把一次性滤杯放在上面,先用稀释液20ml润湿滤膜,取样品1ml 过滤,用适量冲洗液冲洗滤膜。
取下一次性滤杯,用无菌镊子小心取下滤膜,菌面朝上贴在放有胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。
6、培养:培养皿倒置于培养箱内,胰酪大豆胨琼脂培养基,33℃培养5天。
沙氏葡萄糖琼脂培养基,23℃培养7天。
注:1、操作过程中一定要有无菌意识,防止对样品和环境造成污染。
2、此操作没有具体到品种,如果要具体到品种,冲洗量要在符合药典和法规要求的同时通过方法验证来得到。
3、稀释倍数根据样品污染程度进行,次稀释倍数也要经过验证来得到。
薄膜过滤法[最新]
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薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径约为50mm。
选择滤膜材质时候应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用后，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润洗滤膜，供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。
每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
取相当于每张滤膜含1克或1ml供试品的供试液，加至适宜的稀释剂中，混匀过滤。
若供试品每1克或1ml所含的菌数比较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。
用PH无菌氯化钠——蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。
每种培养基至少制备一张滤膜。
阴性对照实验
取实验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。
阴性对照不得有菌生长。
培养和记数：
培养条件和记数方法同平皿法，每片滤膜上的菌数不应超过100个
菌数报告规则
以相当于1克或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或以<1
乘于稀释倍数的值报告菌数。
无菌检查(薄膜过滤法)SOP
无菌检查SOP（薄膜过滤法）1.目的为规范无菌检查方法及无菌检查全过程的操作，最大限度防止试验操作过程造成的污染，确保结果准确。
2.范围本SOP适用于生物制品的中间产品（包括原液、纯化产物、半成品、生产中的液体、辅料等）、成品的无菌检查。
只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
3.定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6.材料6.1.无菌检查用物品、物料要求：所有物品、物料进入无菌室前，均应经过高压蒸汽灭菌（121℃40分钟，放灭菌指示卡）或180℃干烤2小时或其它经过验证的方法消毒后传入无菌室；如不能用前者消毒方式消毒的物品，须经消毒液浸泡、擦拭后传入无菌室。
6.2.无菌检查环境要求：应在环境洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
6.3.仪器、设备与设施集菌仪、显微镜、台式灭菌器、无菌试验室（万级）、超净工作台（万级背景下的局部百级）：每月环境检测（沉降菌、浮游菌、尘埃粒子）合格后，方可使用。
20-25℃培养房或培养箱、30-35℃培养房或培养箱。
6.4.试验用具：洁净工作服（洁净底服、十万级工作服、万级工作服、鞋套）、工作鞋、口罩及帽子；无菌医用手套或一次性乳胶医用手套：试验前及试验过程中用消毒液浸泡消毒；封闭式集菌培养器（双针头、三联及单针头、三联）：薄膜孔径不大于0.45μm，直径约为 50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。
2015版药典薄膜过滤法
2015版药典薄膜过滤法
【实用版】
目录
1.薄膜过滤法的定义和作用
2.2015 版药典对薄膜过滤法的要求
3.薄膜过滤法的具体操作步骤
4.薄膜过滤法的应用范围和优势
5.2015 版药典薄膜过滤法的意义和影响
正文
薄膜过滤法是一种在药学领域中广泛应用的过滤技术，其主要作用是去除药液中的微小颗粒和细菌，保证药物的纯净度和安全性。
在我国，药典是对药物质量的最权威的规定，而 2015 版药典对薄膜过滤法的要求进行了详细的规定，这无疑对药物生产过程中的质量控制提供了重要的参考。
根据 2015 版药典，薄膜过滤法的具体操作步骤主要包括以下几个步骤：首先是选择合适的过滤膜，这需要根据药物的特性和过滤的要求来决定；其次是准备过滤设备，包括安装过滤膜、调试设备等；然后是进行过滤操作，要注意控制过滤速度和压力，避免对药物产生不良影响；最后是清洗和消毒过滤设备，防止污染。
薄膜过滤法在药物生产中的应用范围非常广泛，几乎涵盖了所有的液体药物，其优势在于过滤效果好，不仅能去除颗粒，还能有效去除细菌，而且操作简便，设备投入少，因此受到药物生产企业的欢迎。
2015 版药典对薄膜过滤法的规定，无疑对提高药物质量，保证药物
安全性，推动药物生产技术进步具有重要意义。
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3无菌检查法(薄膜过滤法)操作程序
贵州明湖药业股份有限公司GMP文件目的建立无菌检查法。
依据国家药品监督局《药品生产质量管理规范》(2010年修订)第七十五条范围本标准适用于抗菌药物注射液。
责任人试剂配制人及QA负责人、化验员对本标准实施负责。
内容1 概述无菌检查是检查药品是否染有活菌的一种方法。
2仪器、设备和用具2.1 恒温培养箱及可调20～25℃的生化培养箱。
2.2 显微镜、蒸汽灭菌器、标准pH比色器(0.02％酚磺酞指示液和澳钾酚蓝指示液)、恒温烤箱。
2．3 三角瓶、刻度吸管(1、5、10m1)、玻璃器皿、移液管、试管。
2．3．1 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管衙内或牛皮纸袋内盖严，灭菌备用。
2.3.2 试管、三角瓶等在管(瓶)口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2／3处，用皮纸格管口(包括塞子)包扎严,灭菌备用。
2.3.3 将注射器、针头(8—9号)配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布(或布)内，包扎严密，置带盖容器(瓷盘或铝制饭盒)内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌备用。
2.4 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
2.5 真空泵。
2.6 用具的灭菌将包扎妥的用具(除另有规定外)，在(121土0．5)℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。
适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。
3 试液3.1 75％乙醇溶液配制酒精棉球用。
3.2 碘配溶液配制碘酒棉球用。
3.3 新洁尔灭(1：1000)溶液。
3.4 3-5％甲酚溶液或其他适宜消毒溶液。
3.5 0.02％酚磺酞指示液pH6.8-8.4系列比色液管3.6 溴甲酚蓝指示液pH6.0-7.6系列比色液管。
3.7 2mol/L盐酸溶液。
3.8 2mol/L氢氧化钠溶液。
4 培养基4.1 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。
2015版药典薄膜过滤法
2015版药典薄膜过滤法摘要：一、概述二、薄膜过滤法的原理三、2015版药典薄膜过滤法操作步骤四、注意事项五、对照试验与验证正文：一、概述2015版药典薄膜过滤法是一种用于药品微生物限度检测的方法，该方法操作简便、准确度高，能够有效保障药品的安全性和质量。
本文将详细介绍薄膜过滤法的原理、操作步骤、注意事项以及对照试验与验证。
二、薄膜过滤法的原理薄膜过滤法是利用微孔膜对微生物进行筛选和捕捉，将样品中的微生物分离出来，然后进行培养、计数和鉴定。
微孔膜的孔径大小可以选择，以筛选出所需大小的微生物。
三、2015版药典薄膜过滤法操作步骤1.准备样品：按照药典规定，将待检测的药品制备成适当的溶液或悬浮液。
2.薄膜过滤：将制备好的样品过滤至微孔膜上，利用真空泵或其他方法将溶液中的微生物过滤出来。
3.冲洗：用无菌水冲洗过滤后的微孔膜，去除残留的样品。
4.培养：将冲洗后的微孔膜放入培养基中，进行培养。
培养条件可根据微生物的特性进行调整。
5.计数：培养后，对产生的菌落进行计数，计算微生物限度。
四、注意事项1.操作过程中应严格遵循无菌操作规程，避免微生物污染。
2.选择合适的微孔膜孔径，以保证筛选出目标微生物。
3.冲洗时要充分，避免微孔膜上的微生物残留。
4.培养条件要根据微生物的特性进行调整，以保证菌落的准确计数。
五、对照试验与验证对照试验是验证薄膜过滤法准确性的重要步骤。
通过与公认的微生物检测方法进行对照，评估薄膜过滤法的准确性和重复性。
对照试验可以参照相关标准进行操作。
总之，2015版药典薄膜过滤法是一种有效的微生物检测方法。
通过掌握操作原理和注意事项，可以确保检测结果的准确性。
薄膜过滤法的操作流程
薄膜过滤法的操作流程：分步指南薄膜过滤法一直是化学、生命科学等领域中非常常见且广泛应用
的方法之一。
它可以用于分离固体与液体或者分离两种不同的液体，
通常适用于大分子体积的物质。
以下是实施薄膜过滤法的详细操作流程：
1. 准备工作
在实施薄膜过滤法前，要做好充足的准备工作。
首先，要准备所
需的薄膜过滤器和其他相关的设备，如硫酸玻璃瓶、注射器等。
其次，检查所有仪器设备是否干净和无污染，特别是薄膜过滤器，为了避免
污染，这些过滤器在使用前必须彻底清洗。
此外，确保您已经穿戴好
所需的个人防护装备。
2. 准备样品
样品的准备是薄膜过滤法的一个关键步骤。
按照您的需要，精确
称量样品，或者使用适当的方法将需要处理的样品加入到玻璃瓶或其
他容器中。
3. 过滤
将准备好的样品倒入薄膜过滤器，在样品中加入过滤剂，使用注
射器对过滤器进行吸力，让样品逐渐地过滤到不锈钢过滤器架中的容
器中。
在过滤过程中，处理好设备和仪器的卫生问题并定期检查是否
间断和是否顺利工作。
4. 清洗和回收
样品经过薄膜过滤器过滤后，将过滤器中残留的物质用亲水纯水充分清洗干净，以确保下一次使用时不会污染样品。
对于收集的新液体，必须在适当的温度和密闭条件下保存，准备进一步处理。
薄膜过滤法是实施样品净化及浓缩的有效途径。
依据上述流程每一步进行实施，您可以高效地完成样品过滤的过程。
即使您是新手，也可以轻松地完成操作，同时获得所需的样品。
无菌检查方法(薄膜过滤法)中常见问题
无菌检查方法（薄膜过滤法）中常见问题按照2020年版《中华人民共和国药典》规定，只要供试品性状允许，包括能直接过滤或者经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。
采用薄膜过滤法，可将药物抗菌成分去除，细菌等其他微生物则会遗留在过滤器，对其培养促使生长和繁殖，以此定性或定量检测微生物。
1常见问题及分析1.1供试品溶解不彻底固体注射剂（如密封瓶粉针剂）无菌检查时需要溶解、转移、稀释后再采用薄膜过滤法过渡，在溶解稀释的过程中，溶剂和稀释液的种类、比例和振荡器的使用等因素都会直接影响到供试品的溶解过滤效果。
2020年版中国药典四部无菌检查法中收载的稀释液有0.1%无菌蛋白陈水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，试验研究结果表明，用前两种溶液做稀释剂，其微生物的回收率远高于0∙9%的无菌氯化钠溶液。
如果供试品溶解不彻底，过滤时滤膜会吸附大量供试品，被滤膜吸附的供试品虽经反复冲洗仍不能去除干净，残留在滤膜上的供试品会导致阳性菌不能在规定的条件下生长。
1.2集菌培养器选择不当为了避免操作过程带来的人为污染和人为偏差，大部分实验室会优先选择用一次性全封闭集菌培养器对供试品溶液进行过滤。
全封闭集菌培养器的滤膜材质、孔径及其与检品的相容性是影响试验结果的关键因素。
选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分截留效果，即部分注射剂具有抑菌性，在过滤时易被滤膜吸附，须采用疏水性边缘及低吸附的滤膜，如可选用尼龙膜材质的集菌器。
无菌检查用的薄膜过滤器的淀膜孔径应不大于0.45 μm,该孔径流膜能有效截留微生物。
每片淀膜的总过滤量不宜过大，以避免淀膜上的微生物受损。
目前市面上销售的一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号、规格众多，适用的产品类型也不相同。
如某企业生产的集菌培养器：安甑瓶装药液可选用加长型取样针，无需将样品额外转移，可快速转移检品；西林瓶装粉剂可选用双针座设计，提供全封闭溶解方案，实现溶解、过滤、冲洗一体化操作，避免转移操作；需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂可选用三针座设计，溶解、稀释、过滤、冲洗一体化操作，降低抑菌成分浓度，减少吸附。
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濾膜過濾法
原理:利用0.45±0.02u,直徑為47mm的無菌濾紙在抽氣幫浦真空抽氣上運作,
在將它放在培養液的飽和吸收墊上培養22至24小時,由於大腸菌類無法濾過因而置留在濾膜上,所以可看出菌落。
實驗設備與材料：
所需用具：塑膠培養皿(直徑50mm)6個、無菌濾膜6張、安全吸球、量筒、燒杯數個、錐形瓶、鑷子，取藥杓、秤藥紙，吸收墊，定量玻璃吸管，隔熱板。
所需儀器：過濾抽氣裝置，恆溫培養箱、微量天平、電磁加熱攪拌器。
實驗步驟:
水樣來源---汙水處理廠
1.我們使用的培養基為M-endo agar.
2.二段水以1000mL加入51g M-endo agar.和95%酒精20mL 現在只要需30mL
的二段水所以用下面公式算出所需要的量
M-endo agar 51/1000 = X/30，X=1.53g
95%酒精 20/1000=Y/30，Y=0.6mL
3.然後調備完的東西放入量瓶將磁石放進去，然後放於電磁加熱攪拌器加熱，
它的外圍要用隔熱板圍住，怕後來會發生意外造成人元的損傷，還要隨時注意加熱的狀況，如果沸騰的話就要馬上關掉磁石攪拌器了。
4.等培養基稍微冷卻之後，把它平均的倒入６個4~5mL的空小培養皿，下來等
待凝固後就可以做下一個實驗了。
5.再來之後用六個小燒杯來做十倍稀釋，要先把取回來的水樣樣本取11mL，加
入有100mL的二段水的小燒杯，混合均勻後，再取11mL，加入另一個100mL 二段水的小燒杯，做10-2稀釋，往下繼續做，做到10-5稀釋，所以會有6個濃度各別100mL，分別是原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。
6.稀釋完之後，把小燒杯跟製作好的培養皿和所需要的工具拿到一樓的實驗室
做過濾的動作，由學長親自操作一遍一開始先把0.45μm的濾膜放在真空抽氣幫浦上面，然後用二段水潤洗過一遍，之後要從低濃度稀釋的容易先到，
所以先把10-5濃度的水樣倒入過濾，之後再用二段水將周圍處潤洗過一次確
保都有全部下去，怕有殘留現場的溶液產生，過濾完之後，要使用鑷子小心將濾膜平鋪放入凝固的培養基中，並且用標籤加以標示清楚，往下繼續做，越做越後面時間會花的越來越久，因為濃度的關係，最後一個是將原液過濾，通常原液過濾的時間是最久。
7.最後把做好的培養皿倒放置放入35±１℃的培養箱內培養一天，隔天再去看
結果如何。
實驗的結果:
參考公式：
所選取之大腸桿菌群菌數落＊100 大腸桿菌密度(CFU/100ml)＝────────────────
所有選曲之過濾水樣之體積(ml)
問題:
1.比較同一種樣品以濾膜法,多管發酵法兩種實驗法法所記錄整理出來的數據,
並參照法規所訂之標準,樣品是否超過標準及受到大腸桿菌之污染?請進行合理的解釋和推論。
雖然取的地點不一樣,但稀釋到1000倍都還是有菌,有被大腸桿菌污染! ２.試述濾膜法與多管發酵法之間之異同及優缺點。
多管發酵法的
優點：只須少量的水樣即可進行實驗。
缺點:(1)以統計方法推導,所以在實際菌數上可能有些偏差。
(2)時間較長。
濾膜法的
優點(課本79頁):
(1)短時間內就可獲得結果。
(2)所用水量較多，增加分析時的靈敏度，同時較具有代表性。
(3)培養基製備簡單。
(4)水樣不需特別處理。
(5)數據較精確，再現性高，用已知體積的水樣直接計數。
(6)經費較節省。
缺點(課本79頁):
(1)水樣中的濁度太高或非大腸菌微生物數量過多時，不宜用濾膜法檢驗。
(2)水樣中若存有毒性物質，會被吸附或濃縮於濾膜上，抑制微生物的生長，造
成實驗結果偏低。
(3)容易受環境汙染，使數據失去準確度。
３．試述多管發酵與濾膜法中所使用的ＬＳＴ培養皿，Ｍ－ＥＮＤＯ培養基之特性，並說明其主要用途為何？
(課本76頁)ＬＳＴ培養基中含有膽鹽作為表面張力抑制劑，可抑制大腸菌類以外菌類生長
(課本79頁) Ｍ－ＥＮＤＯ培養液在培養過程中大腸菌類會分解乳糖，產生氣和荃類，而荃類會與Ｍ－ＥＮＤＯ培養基中的鹼性洋紅染料結合，在光線反射下，呈現綠色金屬光澤菌落。
非大腸菌類則否。
４．實驗結果如何決定待測水樣中是否有大腸菌類？
在使用Ｅ－ＥＮＤＯ培養液中，洋紅染料結合，在光線反射下，呈現綠色金屬光澤菌落。
非大腸菌類則否。
心得:
池政奇:
這次實驗比其他的實驗都快了很多，因為不用用到高壓滅菌和依些複雜的動作，所以，水漾上取用汙水處理廠的水，所以實驗做得很好，很明顯的有大腸桿菌的菌落產生，真空幫浦也是一樣第一次用，不過經過學長教完後還是會使用了，在用原水樣的時候過濾超久的，還以為出了什麼問題了，結果是因為過濾的雜質較多所以要等比較久。
謝勝德
這次做的實驗是濾膜過濾法，實驗真的很簡單也很快，因為培養基是要自己做的所以時間又縮短了，而且這次取的的水樣是汙水處理廠的，所以準確度非常高，接下來用到的真空抽氣幫浦，也是以前沒到的，一開始有學長示範，不然真不知道要如何使用，要夾濾膜真的要很小心，不然會破掉，濾膜越做越後面感覺過好慢，才突然發現因為是濃度很高所以會過濾的比較慢，所以代表這次會做得很成功，這次真的很快也很容易就做完了，沒出甚麼差錯。
吳承祐:
這次結果個人覺得還不錯實驗還滿簡單的,加上取自污水處理廠的水和因為稀釋的倍數有到一定的值,最後要用到真空抽氣幫浦,要小心不要讓濾紙破掉,做這次實驗時間上的掌控也還不錯!
參與度:
謝勝德 100%
池政奇 100%
吳承佑 100%。