转基因和克隆动物

多能性细胞研究及其在再生医学领域的应用进展

周琪，1970年4月出生，博士，研究 员，博士生导师；中国科学院动物研 究所所长助理，计划生育生殖生物学
国家重点实验室副主任，干细胞与再
生医学研究中心主任，生殖工程研究 组组长。
主要从事体细胞重编程机制、干细胞及再生医学相关的研究工作。现 已建立多种克隆动物模型（兔、小鼠、牛、大鼠等多种动物），在国 际上率先证明了小鼠克隆的可重复性；首次获得体细胞克隆大鼠，研 究成果发表在 Science, Development, Developmental Biology 等刊物, 并得到了Nature、Science 的高度评价。

主要包括供核的分离、受体细胞的去核、核卵重 组、重组胚的融合、核移植胚的培养与移植。
克隆动物的研究价值和应用前景

克服动物种间杂交障碍，创造出新的物种，培育良种 快速繁殖扩群


加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物
为了解细胞发育的潜能性，细胞核与细胞质之间相互 关系提供研究工具 为研究胚胎发生及其调控提供了新视角

克隆动物存在的问题

作为一个新兴的技术在实践中，克隆动物的成功率还很低， 维尔穆特研究组在培育“多利“的实验中，融合了277枚 移植核的卵细胞，仅获得了“多利”这一只成活羔羊，成 功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞 的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使 用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体， 其成功率也只有百分之几。 此外，出生的部分个体表现出生理或免疫缺限。 克隆技术对伦理道德的冲击。
具有将外源基因遗传给子代的能力，通常把这类动物称 为转基因动物.
如果只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动
物，把这类动物称为嵌合体动物（Chimeric animal）
只有当外源基因整合入的细胞恰为生殖细胞时，才能将
其携带的外源基因遗传给子代，否则，外源基因将不能
传给子代。
一般用胚胎干细胞法、逆转录病毒载体法制备的第 1 代
胚胎干细胞的囊胚注射法构建Cre转基因动物
本方法的优点是：①可用多种方法将外源基因导入ES细
胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便。②可预先在细胞水平上 检定外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 等，故转基因动物外源基因整合率的可控制程度高于微注射 法。③ES细胞注入囊胚以及囊胚移植到子宫，在操作上比 较简便。
基因组DNA和cDNA。反转录病毒载体的容纳量在
10kb以下，不能插入较大的外源基因。
该方法的优点是：①感染率高，且胚胎存活率高。②病 毒DNA随机单拷贝整合。③宿主范围广。 不足之处为：①整合位点是随机的，其整合率不高。由 于病毒感染过程是在多次卵裂之后外源基因很难整合 于所有胚胎细胞中，故多数子代动物是嵌合体。②重 组的反转录病毒不够稳定，外源基因易发生重排或丢 失。③病毒载体的容量不大。④病毒DNA序列可能会
转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第 1 代转基因动物中，也约有20％为嵌合体动物。
二、转基因动物研究进展
㈠ 转基因动物研究的简要回顾
1977年，Gordon首先用微注射的方法将外源mRNA和
DNA注射到非洲爪赡胚胎，发现被注入的核酸完全有功能。 1980年Brinster等利用小鼠胚胎作了类似的研究，表明外 源DNA能够在胚胎细胞转录表达。这些工作奠定了生产可 以“获得新功能”的转基因动物的科学思想和方法。
我国较大规模地进行转基因动物的研究与产业化 开发是由我国“863’计划资助，也是“863”计划最早 实施的高技术项目之一。经过十几年的努力工作，取 得了许多十分显著的成绩
先后获得了生长速度快、瘦肉率高、对某些病毒 有一定抗性的转基因猪，在乳腺组织中能够表达人药 用蛋白凝血因子IX、人生长激素、人红细胞生成素等 的转基因羊。最近，还成功地获得了转基因牛。 1997年，“动物乳腺生物反应器”的研究与开 发列为“863”计划的重大项目，表明一个新的转基因 动物研究与产业化开发高潮已经在我国形成。
转基因动物和克隆动物
一、转基因动物

转基因动物：指染色体基因组中整合有外源基因 并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体 基因组的外源基因被称为转基因。
当制备转基因动物时外源基因可能只整合到动物的部分
组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有组织细胞的
基因组中。如果动物所有的细胞均整合有外源基因，则
理论基础

动物体细胞的全息性：几乎所有的有核体细 胞含有与受精卵相同的一整套遗传物质 卵母细胞（尤其MⅡ卵母细胞）具备对细胞核 具备重编程的能力（reprogramming) 供核细胞与受核细胞之间的细胞周期的协调性 是供核能被有效重编程或正常发育的重要条件



1997年2月，位于英国爱丁堡的Roslin研究所获得了
移植入受体的子宫内，使其发育为嵌合体的转 基因动物。
胚胎干细胞（ES）是指从囊胚期的内细胞团中分离出来 的胚胎细胞，能在体外培养，具有发育全能性的细胞
ES细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞，当被
注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合 体的形成。 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍 体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化
转基因技术原理
通过将纯化的DNA分子导入动物种系生殖细胞基 因组，从而实现对动物基因组的遗传修饰并使其
稳定传代，常用方法：

显微注射法；
胚胎干细胞法；
逆转录病毒转染法
显微注射法

同步获得供体雌鼠（超排的）和受体母鼠（前者
是通过注射雌激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得；
后着是通过与接扎雄鼠交配产生）
英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰 蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母 羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使 这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷 兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公 司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如 何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。

供体鼠注射人绒毛促性腺激素（HCG）32h后， 采集受精卵，此时受精卵有清晰的原核。 用显微注射法将纯化的外源基因片段导入受精卵 的雄原核内


将微注射后经鉴定为存活的受精卵移植到同步
交配的假孕母鼠的输卵管（或子宫）内。其中
一部分移植卵能够继续生长发育成个体

鉴定子代鼠中外源基因的整合和表达。 转基因动物品系的建立。
1985年 Hammer 等利用该方法成功地制作了转基 因兔、绵羊和猪。上述三起研究被认为是动物转基因研 究历程上的里程碑. 转基因动物研究与开发是整个生命科学中近年来发 展最为迅速的领域， 1997年，仅各种不同类型的转基因
（transgenic）小鼠就达到了804种.
1988 年 4 月 12 日美国专利局批准了第一个转基因动物 “原癌小鼠”(oncomouse)专利，稍后还获得了欧洲专 利局批准，打破了“动物生命不允许专利”的铁律。
由成年哺乳动物体细胞克隆成的活羊羔（Dolly）。开 创了哺乳动物体细胞克隆的新
细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质“重排”， 然后逐步发育成胚胎。

1998年美国夏威夷大学采用小鼠卵丘细胞克隆出27只小鼠， 其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多利”以
“克隆”（clone）是指一个遗传单位或一个生命单位， 通过无性繁殖方式，产生生物学上完全相同的遗传单 位或生命单位。动物克隆是一种通过核移植过程进行 动物无性繁殖的技术。
一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切 成 十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就
生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就
后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。

2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克 隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早 夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得， 与克隆“多利”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握 了体细胞克隆的尖端技术。
克隆动物的技术路线
优 点

能将外源基因导入动物生殖细胞，从而实现对整个动物 机体的基因修饰； 可以在机体整体水平研究基因表达所导致的生物学效应 研究周期短；

缺 点

基因整合位点的随机性； 基因表达的位置效应；
胚胎干细胞法

将外源基因直接导入胚胎干细胞，经体外培养
筛选后，通过显微操作将其注射到囊腔中，在
以及性状遗传机制的理想模型。
选择合适的载体，将Cre重组酶的
编码基因与其重组，构建重组质粒 将重组质粒其转人培养的小鼠胚胎 干细胞中。 体外筛选稳定整合外源基因的胚胎 干细胞。筛选出的胚胎干细胞被重 新注射到小鼠囊胚中，并植入到假 孕小鼠的子宫内，使其重新发育为 一个完整的胚胎。 产出的嵌合体小鼠通过杂交，获得 稳定整合Cre重组酶的纯合体转基因小鼠。
我国的转基因研究起步较晚，从80年代初期开始了转基因 动物的研究。中国科学院发育所率先成功地将人-珠蛋白 基因、大肠杆菌galk和 gpt基因、牛及人生长激素等基因， 分别注入小鼠受精卵，获得了多种转基因小鼠。
中国科学院水生所在国际上首先开展了转基因鱼的研究， 并最早获得了转基因鲫鱼个体，转基因鱼是目前国内获 得最为成功的一种转基因动物。
1998年，美国和欧洲专利局共批准了 42种转基
因动物专利，登记注册了88种专利申请。转基因动物
研究正在全世界范围内形成一个前所未有的高潮。并 将成为21世纪生物技术领域的支柱性产业。毫无疑问，
动物转基因正在改变农业、医药、生物材料，甚至是
整个生命科学的研究与发展面貌。