ba总线的L-天冬酰胺酶II发酵过程优化控制
浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究

浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究1. 引言1.1 研究背景L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)是一种能够降解天冬酰胺和L-谷氨酸的酶,通常被广泛应用于治疗白血病和其他恶性肿瘤。
传统来源的L-天冬酰胺酶存在一些问题,如来源不稳定、纯度低、免疫原性强等。
研究者们开始探索通过基因工程技术构建高效表达的重组L-天冬酰胺酶,以应对传统L-天冬酰胺酶存在的问题。
L-天冬酰胺酶的重组表达载体设计和构建是实现高效表达的关键步骤。
通过选择合适的载体和宿主菌株,搭配适当的启动子和调控元件,可以实现L-天冬酰胺酶基因的高效表达。
还需要考虑到蛋白质的折叠、稳定性和可溶性等因素,以确保重组L-天冬酰胺酶的功能完整性和活性。
本研究旨在探讨L-天冬酰胺酶的重组表达载体设计与构建,以及其在纯化、表达及酶活性检测方面的应用。
通过对L-天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究,可以为进一步提高L-天冬酰胺酶的表达水平和活性,以及扩大其应用范围提供重要参考和理论基础。
1.2 研究目的研究目的:通过对L-天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究,旨在深入了解该酶在生物体内的功能和作用机制,探讨其在生物医学和工业领域的潜在应用价值。
具体目的包括:1. 研究L-天冬酰胺酶在代谢过程中的作用,揭示其在生物体内的生物学功能及代谢途径;2. 探讨L-天冬酰胺酶的结构特点,从分子水平揭示其催化机制和底物选择性;3. 设计和构建适用于L-天冬酰胺酶的重组表达载体,实现对该酶的高效表达和纯化;4. 实验验证重组L-天冬酰胺酶的表达效果,研究其酶活性及功能;5. 探讨L-天冬酰胺酶与其重组表达载体研究的意义,为未来相关研究提供理论基础和实验指导。
通过本研究,期望能够全面了解L-天冬酰胺酶及其重组表达载体的特性和应用前景,为进一步的研究和开发提供重要参考。
2. 正文2.1 L-天冬酰胺酶的重要性L-天冬酰胺酶是一种重要的酶类,广泛存在于生物体内,在氮代谢中发挥着关键作用。
浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究

浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究L—天冬酰胺酶(L-asparaginase,简称L-ASNase)是一种重要的酶类蛋白,能够催化天冬氨酸和水解为天冬酰胺和亮氨酸。
由于其能够降低机体内天冬氨酸的含量,从而抑制白血病细胞的生长,L-ASNase被广泛应用于白血病和淋巴瘤的治疗中。
近年来,随着生物技术的发展,对L-ASNase的研究也取得了重大突破,其中重组表达载体的研究尤为重要。
L-ASNase的传统生产方式主要依赖于放线菌属细菌的发酵产生,这种生产方式存在着生产周期长、纯度低、结构不稳定等诸多问题。
为了解决这些问题,研究人员转而将目光投向了重组表达技术,通过对L-ASNase基因进行重组,把其导入到适当的宿主细胞中,利用宿主细胞的生物合成能力来生产L-ASNase,从而得到高纯度、高稳定性的L-ASNase制剂。
在研究L-ASNase的重组表达过程中,选择合适的表达载体成为了关键。
表达载体是指将外源基因导入宿主细胞并在其内进行表达的工具,一般采用质粒作为表达载体。
质粒在重组表达过程中发挥着非常重要的作用,它能够提供适当的转录启动子、选择性标记基因和表达缓冲区等,从而确保外源基因在宿主细胞中得到高效表达。
目前,研究人员已经成功构建了多种不同的重组表达载体用于L-ASNase的表达。
采用大肠杆菌作为宿主细胞表达L-ASNase成为了研究的热点之一。
大肠杆菌因其生长速度快、易于培养以及基因工程改良方便等优点而成为了理想的宿主细胞。
目前已有多种大肠杆菌表达载体被用于L-ASNase的重组表达,通过对不同载体的比较研究,可以筛选出最适合L-ASNase表达的载体,提高L-ASNase的表达效率。
在研究L-ASNase的重组表达载体时,优化表达条件也是至关重要的。
通过对培养基组分、诱导条件、培养温度等进行优化,可以提高重组蛋白的表达量和纯度,从而为L-ASNase的工业化生产提供有力支持。
除了大肠杆菌表达载体外,还有一些其他宿主细胞被应用于L-ASNase的重组表达。
利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ

p a B c T 载体, Fs aH b t 大肠杆菌 D 5 ,H 0 aT H a D 1B c , M B N昆虫细胞 , m 由本实验室保存。 a H I, i 1 Bm Hn 1 d1
等限制性内切酶,4D A连接酶 , T N 质粒柱抽试剂盒 ,
费建明 1 吴 岩 ,占鹏飞 1施 国方 1 王文兵 2 , , ,
(. 1浙江省湖州市农业科学研究院 , 浙江 湖州 3 3 0 ;2 江苏大学生命科学研究院, 10 0 . 江苏 镇江 22 1 ) 10 3
摘
要 : 厂天冬酰胺酶(- saaiaeI A P 可以通过 降解 L 天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞 中蛋白质的正常合成 , I L ap rg s , _ S ) n , _ 导
致肿瘤细胞的死亡。 通过杆状病毒的 B ct -a 方法 , a-o B c - 将大肠杆菌的 ap 因在家蚕杆状病毒 中表达 , s基 其活性较原核表 达有 明显提高 , 达到 2 0 / 。为利用家蚕生物反应器生产该蛋 白提供 了依据 。 80 mg 关键词: 家蚕 ; 多角体 ; - L 天冬酰胺酶; - 大肠杆菌
(. ei h r ReerhIsi t, zo c d m gi l rl c n e, zo 1 0 0 C ia 1 S r u ue sac tue Huh uA a e yo r ut a S i cs Huh u3 3 0 , hn ; c n t fA c u e
wih t e ba u v r ct cs se t h c l iusBa o Ba y t m
FEIJa - i g. U n, in m n W Ya 2ZH AN e g fP S o f n 1W ANG e - ig P n - e , HIGu - a g, W n bn
发酵过程优化与控制(原理部分)

16
大型发酵罐 搅拌装置
17
现代发酵工程的主要研究内容
1.发酵过程的优化控制技术 2.生化过程的模型化 3.高密度培养技术 4.代谢工程和代谢网络控制 5.新型生化反应器的研究和开发 6.新型发酵和产品分离技术
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第一章
绪论
一. 发酵过程优化在生化工程中的地位 二. 发酵过程优化的目标和研究内容 三. 发酵过程优化的研究进展 四. 流加发酵过程的优化控制
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一. 发酵过程优化在生化工程中的地位
现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、 药物的过程中发挥重要的作用,还能经济、清洁地 生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊 化学品,在解决人类面临的人口、粮食、健康、环 境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用 如何才能更好地发挥现代生物技术的作用? 以工业微生物为例,选育或构建一株优良菌株仅仅是 一个开始,要使优良菌株的潜力充分发挥出来,还必 须优化其发酵过程,以获得较高的产物浓度(便于下 游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高 的生产强度(缩短发酵周期) 20
养或半连续发酵,是指在分批发酵过程
中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵
方法
36
流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究 几乎是个空白,流加过程控制仅仅以经验为 主,流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语,并从理 论上建立了第一个数学模型,流加发酵的研究 才开始进入理论研究阶段
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基于碳氢化合物的经济转变为基于 碳水化合物的经济
将工业革命世纪转变到生物技术世纪 只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再
地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其分子改造

地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其分子改造L-天冬酰胺酶可将L-天冬酰胺侧链的酰胺基水解成天冬氨酸和氨,且在微生物中广泛存在。
研究发现L-天冬酰胺酶可以减少热加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成,同时,对生产工艺、产品外观、风味以及营养等方面没有任何影响。
此外,L-天冬酰胺酶也能够用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤等疾病。
但天然L-天冬酰胺酶的低催化活力、低热稳定性等缺陷一直限制着其在食品安全和医疗中的广泛应用。
因此,寻找具有优良性质的L-天冬酰胺酶具有深远意义。
本文主要针对以上问题,首先对地衣芽孢杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因进行了克隆和异源表达,其次对重组酶进行酶学性质初步研究,最后对L-天冬酰胺酶基因进行分子改造,包括定向进化和半理性设计,并对突变酶进行了酶学性质的初步研究。
旨在为L-天冬酰胺酶在食品工业化生产中的应用奠定基础。
本研究结果分述如下。
1.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达。
根据Genbank中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheiforiis)的全基因组序列成功克隆出L-天冬酰胺酶基因ansZ(1131),其编码376个氨基酸,理论分子量为40kDa左右。
构建重组表达载体pET-30a-Bli-ansZ,实现L-天冬酰胺酶基因ansZ在Escherichia coli中异源表达,重组酶酶活为3.97±0.16 IU/mL。
纯化后重组酶酶学性质研究表明,其比活为148.83 IU/mg;最适催化反应条件为pH8.0,40℃;在pH5.0到pH10.0环境下表现出高于70%以上的残余酶活;50℃处理8 h后仍保留80%以上残余酶活;动力学参数米氏常数Km为0.692 mM,最大反应速度Vmax为1.68IU/μg。
表明该重组酶其具有相对较宽的pH适应活性范围和较好的热稳定性,利于其在食品加工中的应用。
2.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的定向进化.易错PCR反应体系为dCTP、dTTP各0.2mM,Mn2+浓度0.05mM、Mg2+浓度3/5/7mM。
天冬酰胺酶生产的工艺流程

天冬酰胺酶生产的工艺流程天冬酰胺酶是一种广泛应用于工业和生物技术领域的酶类制剂,具有较高的市场需求和广泛的应用前景。
天冬酰胺酶通过生物技术手段进行生产,其生产工艺流程包括菌种培养、发酵、提取纯化等多个环节。
本文将对天冬酰胺酶的生产工艺流程进行详细的介绍和分析,旨在为相关行业提供参考。
一、天冬酰胺酶的特性及应用天冬酰胺酶是一种催化天然产物生物合成反应的酶类制剂,其具有催化效率高、底物特异性好、工艺条件温和等特点,因此在医药、食品、化工等领域有着广泛的应用。
在医药领域,天冬酰胺酶可以用于药物合成和转化;在食品工业中,天冬酰胺酶可以用于酿造、乳品加工等;在化工领域,天冬酰胺酶可以用于有机合成和环保领域。
由于其广泛的应用前景,天冬酰胺酶的生产技术日益受到关注。
二、天冬酰胺酶生产的菌种培养天冬酰胺酶的生产首先需要获得高产菌株,并进行大规模培养。
在菌种培养过程中,需要选择优良的菌株,并进行培养基的筛选和培养条件的优化。
培养基的选择应考虑到天冬酰胺酶的生物合成代谢途径和微生物自身生长特性,一般而言,培养基的基本成分包括碳源、氮源、矿质盐和生长因子等。
培养条件的优化需要考虑到温度、pH值、氧气供应、搅拌速度等因素,以促进菌株的快速生长和高产酶。
三、天冬酰胺酶的发酵过程天冬酰胺酶的发酵过程是整个生产流程中最为关键的环节。
在发酵过程中,需要加入经过严格筛选后的高产菌株和优化配方的发酵基质,并采取合理的发酵工艺条件,如温度、pH值、氧气供应等。
通常情况下,采用的发酵设备有罐式发酵罐和发酵塔等。
在发酵过程中,微生物菌体会进行代谢活动,合成并分泌出天冬酰胺酶。
发酵过程需要进行严格的监控和控制,以确保天冬酰胺酶的高效产生和纯度。
四、天冬酰胺酶的提取和纯化天冬酰胺酶的提取和纯化是将其从发酵基质中提取出来,去除杂质并获得高纯度的天冬酰胺酶的过程。
提取和纯化的方法多种多样,包括有机溶剂萃取、超滤、色谱层析等。
此过程需要根据天冬酰胺酶的特性和发酵基质的成分选择最佳的提取和纯化方法。
浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究

浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究L-天冬酰胺酶 (L-asparaginase) 是一种重要的酶类蛋白,具有去除体内过量天冬酰胺和抑制蛋白质合成的作用。
由于其在治疗白血病和其他恶性肿瘤方面的潜在应用价值,L-天冬酰胺酶已经成为了研究的热点。
由于天然来源的L-天冬酰胺酶存在着许多不足,如短半衰期、免疫原性和抗原性等问题,因此提高其稳定性和活性成为了研究的重点之一。
而重组表达载体则成为了增强L-天冬酰胺酶性能的有效手段之一。
本文将就L-天冬酰胺酶及其重组表达载体的研究进行浅谈。
L-天冬酰胺酶是一种能够水解天冬酰胺生成天冬酰氨酸和α-酮戊二酸的酶,它广泛存在于微生物中,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和放线菌等。
除微生物外,植物和动物也存在着L-天冬酰胺酶的活性。
在体内,天然L-天冬酰胺酶主要存在于脾脏、肝脏和肠道等组织中,可耐酸碱性和高温,其主要作用是将天冬酰胺水解为天冬酰氨酸和α-酮戊二酸,以供细胞代谢使用。
而在临床上,L-天冬酰胺酶被广泛应用于治疗急性淋巴细胞白血病和其他恶性肿瘤,其机制是通过限制白细胞对天冬酰胺的利用,从而抑制白细胞增殖。
天然来源的L-天冬酰胺酶存在着诸多局限性,如免疫原性强、抗原性明显、短半衰期、易诱导抗药性等。
这些不足严重制约了L-天冬酰胺酶在临床治疗中的应用。
研究人员开始尝试通过改良L-天冬酰胺酶结构和性质来提高其在治疗中的应用价值。
重组表达技术被广泛应用于此,通过改变L-天冬酰胺酶的表达载体,可以增强L-天冬酰胺酶的稳定性和活性,从而提高其在临床中的应用前景。
在研究L-天冬酰胺酶重组表达载体的过程中,利用大肠杆菌、大肠杆菌类爪状疱疹病毒表达载体、棒状病毒表达载体、酵母表达载体和哺乳动物细胞表达载体等多种系统进行表达。
在构建表达载体时,研究人员还尝试使用不同的启动子和调控元件来调节L-天冬酰胺酶的表达水平,以增强其在宿主细胞中的稳定性和表达效率。
还存在着一些研究专门针对L-天冬酰胺酶的亲和纯化和结构域工程等方面进行研究。
基于现场总线的L-天冬酰胺酶Ⅱ发酵过程优化控制

W U a — p n XU o — g o Xi o e g, Ba u
( c ol f o mu iai n ot l n ie r g o tenY n t nvri , x i gu2 4 2 , hn ) Sh o m nct na dC nr gne n ,Suhr a g eU iest Wu i a s 112 C ia oC o oE i z y Jn
吴晓鹏 。 保 国 徐
( 江南大学通信 与控 制工程 学院 , 江苏 无 锡 242 112)
摘要 : 简要介绍 L一天冬酰胺酶 I 和 P O IU I R FB S—D P现场总线 , 针对传统发酵过 程控 制系统布线复杂 、 自动化程 度低等缺 陷 , 了一个基于 P O I U 设计 R FB S—D P现场总线 的 L一天冬酰胺酶 I发酵过程的优化控制 系统 , I 通过 P O I U R FB S—D 总线 , P 主站 、 从站和各智能仪表间可直接通信 , 形成开放性 网络 。 为了提 高最 大产酶量 , 将智能 、 优化控 制技术融入过 程控制系统 , 着重采用神经 网络非线性 预测控制和粒子群优 化算 法解决溶解氧的优化 问题 , 达到较好 的控制 效果 , 产酶 量比原工艺提 高 l 以上 。 倍 实验证 明: 该系统经济 、 可靠 。 关键词 : 现场总线 ; 神经 网络 ; 粒子群优化算法
中圈分类 号: P 7 . T 2 3+ 5 文献标识码 : A
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预估, 所以优化问题成为一个多阶段动态规划问题。 基本思 路是: 在控制时刻 ;, 由粒子群优化算法确定一个控制参数 [ 溶解氧 !" ( #)的设定值 !" $% ( #) ] , 根据当前时刻的产物 浓度 & ( #) 、 菌体浓度 ’ ( #) 、 基质糖浓度测量值 $ ( #) , 用神经
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基金项目: “ 十五”国家高技术研 究 发 展 计 划 ( !"# )基 金 资 助 项 目 ( $%%$&&$’(’#’ ) 收稿日期: $%%) * %# * %’
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验。一个 经 过 优 化、智 能 控 制 的 !"# 发 酵 罐 产 酶 量 高 达 !$$% & ’(, 比原工艺提高 ) 倍以上, 发酵周期仅为 )* L !$ 小 时, 具有很好的工业生产前景。
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迭代过程中自适应进行调整, 因此对于不同的连接权系数实 际采用了不同的学习率, 也就是说误差代价函数 ! 在超曲面 上在不同的方向按照各自比较合理的步长向极小点逼近。 隐层节点个数选取的方法是先从 ! 个节点试起, 网络训 练集和检验集不变, 逐渐增加隐层节点数, 比较检验均方误 差, 选取能以较少的训练次数达到较高精度的节点数作为最 后的网络隐含层节点数。 检验均方误差为 " ! " #
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系统硬件结构及配置
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基于现场总线的 ! " 天冬酰胺酶 ## 发酵过程优化控制
吴晓鹏, 徐保国
( 江南大学通信与控制工程学院, 江苏 无锡 $’,’$$ ) 摘要: 简要介绍 . * 天冬酰胺酶 // 和 0123/456 * 70 现场总线, 针对传统发酵过程控制系统布线复杂、 自动化程度低等缺 陷, 设计了一个基于 0123/456 * 70 现场总线的 . * 天冬酰胺酶 // 发酵过程的优化控制系统, 通过 0123/456 * 70 总线, 主站、 从站和各智能仪表间可直接通信, 形成开放性网络。 为了提高最大产酶量, 将智能、 优化控制技术融入过程控制系统, 着重采用神经网络非线性预测控制和粒子群优化算法解决溶解氧的优化问题, 达到较好的控制效果, 产酶量比原工艺提高 ’ 倍以上。 实验证明: 该系统经济、 可靠。 关键词: 现场总线; 神经网络; 粒子群优化算法 80$(# 9: )+ + 中图分类号: 文献标识码: &
/)$ & ,+++ 工控机, 以带有 0, 和 1,+ 接口的西门子 23 . 4$$ 系 列 ,#( -,% 为 4)4- . !0,) 作为主站, 上位机通过编程电缆 与 ,#- 主站相连, 它即可直接对 ,#- 主站进行编程和调试, 又可对从站从现场反馈回来的数据信息进行集中监视、 记 录。 ,#- 主站的主要任务是远程监控各个从站, 实现对多个 发酵罐的集中调控、 管理。 从站采用西门子 23 . !$$ 系列 ,#( -,% 为 !!/15) , 它与 ,678+9%2 接口扩展模块 :1!33 相配套使用, 从站的主要任务是实现对单个发酵罐的过程控 制, 运用智能、 优化算法, 得到最大产酶量。
6 6
$ ( + ( ,) 、 产物浓度 & ( + ( ,) ( 神经网络输出) , 所选择的神经
6
网络的输入为: 发酵时间 +、 当前时刻的 => 值 -. ( +) 、 当前时
图 #" 系统的整体结构示意图
刻的溶氧值 !" ( +) 、 当前时刻的菌体浓度 ’ ( +) 、 当前时刻的 基质总糖浓度 $ ( +) 、 当前时刻产物浓度 & ( +) 。 为了减少网络 节点数、 减少计算量, 每个浓度都单独建立一个神经网络模 型。 标准 /& 算法的一个严重的缺点是收敛太慢, 这影响了该 网络的实际应用。 由于学习速率 ! 不好选择, 选得太小则收 敛太慢, 若选得太大则有可能修正过头, 导致振荡甚至发散。 采用变学习速率算法
( 1) ( 1) (! ( #) ! 0 23 ( # ( ) ) 4 0 23 23 ( #) ( 1)
$"
发酵过程的控制
发酵过程控制有三个目的: 提高过程稳定性、 克服各类
扰动、 优化过程行为。 在 # . 天冬酰胺酶 ++ 发酵过程优化中关 键问题是溶解氧优化问题。 由于发酵过程有高度非线性、 时 变性和不确定性, 因此建立准确的数学模型非常困难, 导致 一般的优化控制算法无法解决此类问题。 不过在长期的工业 生产过程中, 积累了大量的发酵过程批报数据, 可以利用那 些发酵时间短、 产量高的批报数据, 来寻求最适宜的溶解氧 变化轨迹。 $% #" 溶解氧的实时优化控制 # . 天冬酰胺酶 ++ 研制过程中首先在中试发酵罐中进行 参数的最优化工作, 采用正交试验的方法, 得到影响发酵的 主要参数 ( 溶解氧)的优化轨迹。 由于控制系统具有很强的 数据采集和存贮、 曲线优化分析等功能, 大大缩短了中试周 期。 这组优化参数放大应用到生产发酵罐时, 需进行进一步 的寻优, 这里采用神经网络非线性预测控制和粒子群优化算 法对溶解氧实时优化控制。 由于神经网络模型只能进行二步
()) (!) (4)
( # 5 )) ( #) 4 ! ! !
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! ( # 5 )) ] [ ! ( #) " 4 678
( 1) 23
( 1) 23
当连续两次迭代其梯度方向相同时, 表明下降太慢, 这 时可使步长加倍; 当连续两次迭代其梯度方向相反时, 表明
( 1) 下降过头, 这时可使步长减半。 在修正 0 是按 # 23 ( # ( ) )时,
图 !"
溶解氧的实时优化控制框图
4 * ) * )<
状态预估的 9, 神经网络
神经网络模型的长处在于它能很好地实现非线性的、 不 能以通常数学方式表达的函数关系, 发酵过程最难的就是得 不到精确的或者比较可靠的数学描述。 因此用神经网络模型 通过可在线测量的参数较准确地在线预测各种生物参数值, 对过程的优化有着相当重要的作用。 这里采用 9, 神经网络, 训练样本集主要来自生产车间的发酵报表数据, 为了估计发 ( + ( ,) 、 基质总糖浓度 酵过程中下一个时刻的菌体浓度 ’
巴瘤和白血病的治疗, 但我国目前临床使用的 . * 天冬酰胺 日本进口, 价格昂贵。 因此, 在拥有优良菌 酶 // 主要从美国、 种条件下, 研究如何提高它的发酵水平就显得很重要。 发酵 过程中, 罐温、 罐压、 @\ 值、 溶解氧、 消泡等都会对产酶形成 影响, 但溶解氧的影响最大。 现场总线控制系统 ( 3I6)是 $’ 世纪自动控制系统发展
!$%&’()(*+,(&- ## .-)/-,0(0+1, 2)13-&& 41,0)15 6(&-7 1, .+-5789&
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