八、检测口蹄疫病毒抗原的方法
口蹄疫病毒抗体检测
2019年第7期 吉林畜牧兽医·经验交流·JingYan JiaoLiu口蹄疫病毒抗体检测白 翠，王 楠，王 晶，马晓媛，于钦磊吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062摘 要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见于人和其它动物。
世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。
我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的 效果来制定合理免疫程序。
本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。
关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。
1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。
最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。
本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。
液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。
2 3ABC非结构蛋白抗体检测经抗原纯化过的口蹄疫疫苗，去除了绝大部分3ABC非结构蛋白[2]，因此，用灭活疫苗免疫的健康动物体内正常不会有3ABC非结构蛋白抗体产生，而自然感染的动物体内由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大，不仅产生了结构蛋白而且也产生3ABC非结构蛋白抗体。
所以，用该方法可以区分自然感染和免疫抗体。
O型口蹄疫正向间接血凝抗原使用说明书1
O型口蹄疫正向间接血凝抗原使用说明书一、原理用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。
若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。
这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。
二、适用范围主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。
三、试验器材1、96孔1100V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板2、微量移液器（50微升25微升）取液塑咀3、微量震荡器4、O型口蹄疫血凝抗原5、O型口蹄疫阴性对照血清6、O型口蹄疫阳性对照血清7、稀释液8、待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟四、试验方法1、加稀释液在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50微升。
2、稀释待检血清取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧3-4次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。
此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2(1)、1:4(2) 、1:8(3) 、1:16(4) 、1:32(5) 、1:64(6) 、1:128(7) 、1:256(8) 、1:512(9)。
取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意：每取一份血清时，必须更换塑咀一个。
3、稀释阴性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。
此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2-1:16。
第6-7孔为稀释液对照。
4、稀释阳性对照血清在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。
口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测方法概介
口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、烈性、高度接触性动物传染疫病，具有宿主范围广、传播快、危害巨大等特点，位居世界动物卫生组织（OIE）规定的A类动物疫病之首，我国也列为一类动物疫病，对畜牧业发展和公共食品安全危害巨大。
目前绝大多数国家和地区仍然采取以灭活疫苗免疫为主的防控措施，所以有效抗原含量的高低直接决定口蹄疫疫苗的品质和免疫后特异性抗体水平的高低。
口蹄疫疫苗的生产环节必须严格遵守药品生产质量管理规范（GMP）标准对各个生产工艺环节实行全程追踪，包括细胞密度与活力、病毒的接种与收获、灭活、浓缩纯化、乳化与分装等，对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗抗原量的监督控制。
目前，国外对于疫苗品质的评判主要是检测疫苗的PD50，鉴于我国对口蹄疫采取国家强制免疫的防控措施，每年检测口蹄疫疫苗PD50所需要的靶动物量较大，并且符合PD50检测需要的靶动物也比难购买，因此迫切需要建立一种能高效批量检测口蹄疫灭活疫苗生产中有效抗原含量的实验室检测技术，实时对疫苗生产各环节抗原含量进行有效监控，建立与疫苗效力检验PD50的相关性，切实为加快我国对口蹄疫的防控与净化保驾护航。
目前，对于口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测的技术包括以下几种：一酶联免疫吸附技术（ELISA）主要是采用双抗体夹心法进行检测，首先使用纯化的口蹄疫病毒抗原免疫BALB/C小鼠，取抗体效价到达要求的小鼠脾脏分离脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）经PEG-4000进行细胞融合，并利用有限稀释法进行3-5次亚克隆，筛选出阳性值高、分泌稳定且特异性强的杂交瘤细胞株扩大培养并及时冻存，大量制备腹水型单克隆抗体并进行纯化，利用抗体亚型鉴定试剂盒对收集的腹水型单抗进行亚型鉴定，利用间接免疫荧光技术（IFA）对制备的单克隆抗体进行验证，同时建立病毒抗原与腹水型单抗之间的线性关系。
2016年福建高职招考生物模拟试题：胚胎工程
2016年福建高职招考生物模拟试题:胚胎工程【试题内容来自于相关网站和学校提供】1：人工获得胚胎干细胞的方法是：将细胞核移植到去核的卵细胞中，经过一定的处理使其发育至某一时期，从而获得胚胎干细胞。
“某一时期”最可能是A、受精卵B、囊胚C、八细胞胚D、原肠胚2：下列关于哺育动物胚胎发育和胚胎工程的叙述,正确的是（）A、原肠胚的三胚层逐渐分化形成各种器官原基B、在囊胚期，滋养层细胞发育成胚胎的附属结构C、在胚胎移植时受体母畜必须经过免疫学检验以防止排斥外来胚胎D、囊胚外表面的一层扁平细胞不断增殖分化，发育成的胚胎3：排卵的有关叙述正确的是（）A、牛排卵时排出的是初级卵母细胞B、精子与卵子受精后发生排卵C、排卵时已完成减数分裂，因此，排出的卵子仅含体细胞一半的遗传物质D、排卵后卵子进入输卵管，准备与精子受精4：高三学生小明最近到医院体检，体检报告中的肝功能检验结果显示：乙肝抗原呈阴性(－)，乙肝抗体呈阳性(＋)。
他说自己没有注射过乙肝疫苗，就此结果向你咨询，你应该给他怎样的合理建议(说明：“＋”表示有，“－”表示没有（）A、你体内带有乙肝抗体，说明一定也有乙肝病毒，需要到医院就诊B、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，一定是妈妈怀孕时传递给你的免疫力C、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，说明你可能曾感染乙肝病毒后痊愈了D、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，这是父母遗传给你的免疫力5：下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是（）A、卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加B、胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割C、胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点D、胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取6：（2013福建理综）克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。
Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR 技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。
实验报告口蹄疫诊断
实验报告口蹄疫诊断实验报告：口蹄疫诊断摘要：口蹄疫是一种严重危害牲畜健康的疾病，及时准确的诊断对于控制疫情的蔓延至关重要。
本实验旨在探讨口蹄疫的诊断方法，并评估其准确性和可行性。
通过实验结果的分析，我们可以得出口蹄疫的诊断方法及其在疫情控制中的重要性。
引言：口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病，主要影响牛、羊、猪等偶蹄类动物。
该疾病在全球范围内广泛流行，给畜牧业造成了严重的经济损失。
及时准确地诊断口蹄疫对于控制疫情的蔓延至关重要。
目前，常用的口蹄疫诊断方法包括病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等。
然而，这些方法在实际应用中存在一定的局限性，因此需要进一步研究和改进。
材料与方法：本实验选取了一批可能感染口蹄疫的动物样本，包括血清、组织和病毒等。
采用了病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法对这些样本进行分析，并比较了它们的准确性和可行性。
结果：通过实验分析，我们发现病毒学检测方法对口蹄疫的诊断具有较高的准确性，但需要较长的检测周期。
血清学检测方法具有快速、简便的优点，但其准确性相对较低。
分子生物学检测方法在口蹄疫诊断中表现出了较高的敏感性和特异性，是一种较为可靠的诊断方法。
讨论：口蹄疫的诊断方法是口蹄疫防控工作中的关键环节，不同的诊断方法各有优劣。
病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法可以相互补充，提高口蹄疫的诊断准确性和可行性。
在口蹄疫的防控工作中，应根据具体情况选择合适的诊断方法，并不断改进和完善口蹄疫的诊断技术。
结论：口蹄疫的诊断方法对于口蹄疫的防控具有重要意义。
病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法在口蹄疫的诊断中都具有一定的优势和局限性，需要综合考虑并不断改进完善。
口蹄疫的诊断技术的进步将为口蹄疫的防控工作提供重要的支持和保障。
简述口蹄疫免疫抗体监测的方法及意义
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
家畜口蹄疫的免疫抗体检测方法
652017.10·近年来，基于牛羊口蹄疫的严重危害，我国已经将其列入强制免疫的范围，因此，能否及时做好免疫抗体的效价检测不仅仅是关系到能够做好免疫质量评价的关键，同时也是关系到能否为牛羊口蹄疫免疫提供科学依据的关键。
但是，在实际工作中，由于所采用的抗体检测方法不同，往往会导致检测的结果呈现出一定的差异性，因此科学选择抗体检测方法尤为重要。
正向间接血凝实验和液相阻断可以说是2种常用的抗体检测方法。
为此，通过平行对比检测试验的方法对2种检测手段进行分析。
1 材料与方法1.1 被检测血清检测血清采用随机抽取的方法，主要来源就是已经成功注射牛羊o型-亚洲I型口蹄疫双价灭活疫苗的牛血液样品与羊血液样品，建议在21d左右的时间进行血样提取，在完成血清的分离后，将待检血清置于4℃左右的冰箱保存。
1.2 关于诊断试剂所选用诊断试剂为同一生产批号的口蹄疫O型正向血凝抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液以及O型口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒。
1.3 关于检测方法及结果的判定正向间接血凝试验一定要严格按照说明进行操作，如果抗体的效价高于1：32的话，即可视抗体为合格；同样，O型口蹄疫液相阻断也要严格按照说明进行操作，在结果的判定方面我们通常是将病毒抗原对照的平均OD值的一半为临界值，也就是参考值，如果被检血清的OD值高出临界值，那么为阴性孔，如果低于临界值，就为阳性孔，需要注意的是，阳性孔的最高稀释度就是血清的抗体效价，如果高于1：64的话，我们可以认为抗体合格。
2 结果通过正向间接血凝检测，发现抽取的牛羊样本中，口蹄疫的免疫合格率分别为81.9%和83.67%，也就是说在所抽取的105头牛和98只羊中，分别有86头和82只羊的抗体检测是合格的。
3 结果分析从检测的实际结果来看，无论是正向间接血凝检测，还是液体阻断检测，结果是基本相符合的，也就是说对于同一批血清的检测抗体效价来说，具有显著的对应关系、任何一种检测方法敏感性和特异性低相对显著，试验结果科学、可靠。
【动科前沿】口蹄疫检测技术新进展
【动科前沿】⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫诊断检测技术正在不断改进和创新，已从细胞培养、⾎清学诊断技术扩展到分⼦⽣物学诊断技术领域。
这些新技术不仅敏感、特异、⽽且简便、快速、经济、⾼通量化。
⼀、病原学检测技术1新的敏感细胞系因⽜甲状腺原代细胞和羔⽺原代细胞在⽣产上存在问题，尤其是很少进⾏⼝蹄疫诊断的实验室及因⼝蹄疫呈地⽅流⾏性的地区，很难得到⼝蹄疫阴性的动物。
⽽现有的细胞系对⼝蹄疫敏感性存在局限性，因此，研究者对⼝蹄疫毒更加敏感的细胞系的进⾏了研究。
Brehm等建⽴了⾼敏感⼭⽺胎⼉细胞系，结果表明，在分离7个⾎清型的⼝蹄疫病毒更加敏感。
并且该细胞还可以分离猪⽔泡病毒和⽔疱性⼝炎病毒。
LaRocco(2013)年将αv亚基和β6亚基同时导⼊到⽜肾细胞系中构建稳定表达细胞系LFBK-αvβ6,结果表明β6亚基⾄少在100代可以稳定表达，且增强了对⼝蹄疫病毒的易感性。
2分⼦⽣物学诊断技术2.1环介导转录等温扩增技术⼝蹄疫的传统诊断⽅法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。
另外，常规反转录聚合酶式反应和实时定量聚合酶式反应⽤来补充⼝蹄疫病毒感染的最初诊断⽅法。
然⽽，这些检测⽅法⽐较费⼒，并且需要昂贵的试验室设备。
为解决这些问题，Yamazaki等⼈建⽴了⼀个简单、快速和实⽤的反转录的环介导等温扩增⽅法鉴定动物及其产物中的⼝蹄疫病毒。
反转录环介导等温扩增⽅法⾸先是由Notomi等⼈报道的，并且成功应⽤于许多病毒的检测，李健等利⽤环介导等温扩增技术建⽴了⼝蹄疫快速检测⽅法，同时评价了该⽅法的灵敏性和特异性。
该检测⽅法检测体系具有极⾼的特异性，只能检测到⽬标病毒，与其他类病毒物较差反应，灵敏性较⾼。
2.2实时荧光定量反转录聚合酶链式反应荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每⼀个循环产物荧光信号的实时监测，从⽽实现对起始模板定量及定性分析。
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八、检测口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。
该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。
1．试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。
２．试验方法（１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。
（２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。
（３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。
每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。
取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。
其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。
经过上述稀释，各阳性抗原的稀释度依次为1：48、1：96、1：192和1：384。
用于阳抗对照孔的只加第4管（1：384）的阳抗。
（４）滴加待检抗原和对照抗原取第8管稀释的待检抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待检抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待检抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均为50微升。
1~5排的第10孔加入1：40的阴性抗原，每孔50微升。
1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1：384稀释度的阳性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。
1-5排的第12孔各加稀释液50微升作为稀释液对照。
（５）滴加反向被动血凝诊断液血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O 型诊断液，每孔25微升。
第2排1~8孔和10~12孔加入A型诊断液，每孔25微升。
第3排1~8孔和10~12孔加入C型诊断液，每孔25微升。
第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液，每孔25微升。
第5排1~8孔和10~12孔加入SVD诊断液，每孔25微升。
（６）振荡血凝板加毕诊断液后，立即将血凝板置于微量振荡器上，中速振荡30秒，取下血凝板放在白纸上观察各孔的红细胞是否均匀悬浮，孔底应无红细胞沉淀，若全部或部分孔底尚有红细胞沉积，应继续在振荡器上振荡，直至充分混匀为止。
（７）室温下静置将混匀的血凝板，盖上玻璃板后静置2小时，判定检测结果，若对照孔红细胞沉降不清晰或因故来不及判定，也可静置第2天判定。
３．判定标准先观察血凝板上1~5排的10~12孔，每排的第10孔为阴性抗原对照孔，应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成边缘整齐的小圆点；每排的11孔为阳性抗原对照孔，应出现“++”~“#”的凝集现象（即有50~100%红细胞发生凝集，红细胞悬于孔中，不沉入孔底），证明所加的反向诊断液效价不低于1：384，用于检测抗原合格；每排的第12孔为稀释液对照孔，也应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成小圆点。
在上述对照孔判定合格的前提下，仔细观察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++”~“#”凝集现象，而其余4排仅在1~2孔出现“+”~“++”的凝集，即可判定该份待检抗原为阳性。
其型别与所加的反向诊断液的型别相同。
比如第1排1~8孔出现“++”以上的红细胞凝集，第2~5排无此现象，便可判定该待检抗原为O型口蹄疫。
以出现“++”以上凝集的待检抗原最大稀释度为其抗原滴度。
例如第1排的1~4孔出现“#”凝集，第5孔出现“+++”凝集第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集现象，即判定该待检抗原为O型，滴度为1：192（以第6孔出现“++”凝集为滴度的终点）。
４．注意事项（１）勿用90o和110 o血凝板，防止误判。
（２）阴性抗原、阳性抗原和稀释液3孔对照全部或部分出现不合格时，检测结果不能判定，应更换试剂重新检测，以免错判。
（３）严重腐败变质的病料不宜检测，以防非特异反应。
（４）病料太少，无法检测时，可制成1：10或1：20悬液，先接种3~5日龄小白鼠，连传3代后，用鼠组织制成待检抗原，再进行检测。
（５）检测过程中，有时出现前带现象，即第1孔或第2孔的红细胞沉淀形成小园点，第3孔以后又出现“++”以上的凝集，这是因为抗原抗体比例失调所致，不影响结果判定。
反向被动红细胞凝集试验的诊断液及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所供应。
（二）口蹄疫微量补体结合试验补体的作用是无特异性的，它能与任何一组抗原抗体复合物结合并不再游离。
但不能单独与抗原或抗体结合。
当抗原与其相应的抗体结合成复合物之后，可与补体结合，但这种反应不能用肉眼观察。
如果抗原是红细胞与其相应抗体（溶血素）形成复合物后，当有补体存在时，红细胞就发生溶血；如补体已被其他抗原抗体复合物结合，则不溶血。
这种现象用肉眼是可以观察到的。
因此利用溶血反应作为指示剂，以检验补体是否已被前一种抗原抗体系统所结合，这种试验叫做补体结合试验。
前者称为溶菌系统或试验系统，后者称为溶血系统。
如果溶菌系统的抗原抗体是相应的，则补体被结合，加入溶血系统后不发生溶血。
反之，二者不对应，则补体游离，加入溶血系统后发生溶血。
所以在补体结合试验中，溶血判为阴性；不溶血则判为阳性。
操作步骤如下：１．测定溶血素效价（1）取试管10支列于管架上，1~10管内各加生理盐水0.5毫升（2）取溶血素0.2毫升加生理盐水9.8毫升=1:100 的溶血素。
（3）取1：100的溶血素1毫升加生理盐水4毫升=1：500溶血素。
（4）取1：500的溶血素0.5毫升加入第1管混匀并取出0.5毫升加入第2管混匀，并取出0.5毫升加入第3管……以此类推，直至第8管。
并取出0.5毫升弃去，1~8管的溶血素稀释度依次为1：1 000~1：8 000，第9、10管为对照管。
（5）将补体（豚鼠血清）用生理盐水稀释成1：10，1~9管各加0.5毫升，第10管不加补体而加1：500的溶血素0.5毫升。
（6）将洗净的红细胞沉淀用生理盐水配成2%浓度，1~10管各加0.5毫升。
（7）每管充分混匀置37℃水浴中作用20分钟后判定效价。
（8）以出现完全溶血的溶血素最大稀释度为其效价。
溶血素效价滴定表（剂量毫升）试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10生理盐水 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51：500溶血素 0.5补体（1：10） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(1:500溶血素)红细胞（2%） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.537℃20分钟判定效价———— + ++ +++ ＃＃＃按此表滴度结果，该溶血素效价＝1：4 000，工作浓度为效价的4倍即1：1 000。
1．测定补体效价溶血素效价被测出后，即可滴定补体效价。
新鲜补体或冻干补体被稀释后，容易失效，宜用10% NaCl保存，即补体1份十10%Nacl 1份，混合后置4℃或-20℃贮存有效期2~3个月。
取保存补体2毫升加生理盐水8毫升=1：10的补体。
按下表程序及剂量进行滴定。
补体效价滴定表（剂量:毫升）试管号 1 2 3 4 5 6 78生理盐水 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350.4补体（1：10） 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 溶血素（工 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5作浓度）红细胞（2%） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 37℃30分钟判定——— + ++ +++ ＃＃以出现完全溶血的补体最大稀释度为其效价。
按此表测出的该补体效价为0.35，工作浓度为0.45。
以上A和B两步骤称为预备试验，溶血素一般半年滴定一次。
而补体则必须在每次试验前滴定，如果补体效价不准确，将会影响试验的结果。
3．将标准血清（已知阳性血清）用生理盐水稀释成1：4（阴性血清1毫升加生理盐水3毫升）。
标准血清的补反效价必须达到1：80以上）。
4．在96孔或24孔U型微量滴定板上，1~5排的1~7孔，各滴2滴（约50微升）生理盐水，半小时后弃去，以防板孔对反应成分的非特异吸附。
①将待检抗原稀释成1：3、1：6、1：12和1：24，分别滴入1~5排的1~4孔，每孔1滴（约25微升）。
②第1-5排的第5孔滴入阴性抗原各1滴；1~5排的第6孔依次分别滴入O、A、C、Asia-I 型和SVD阳性抗原1滴，1~5排的第7孔各滴入盐水1滴,作为阴性、阳性和盐水对照。
③1~5排的1~4孔依次分别加入O、A、C、Asia-I 型和SVD标准清1滴（25微升）。
④1~5排的1~7孔各加补体工作浓度2滴（50微升）。
⑤微量振荡器上振荡1分钟，37℃温箱保温40分钟。
⑥每孔各加溶血素工作浓度1滴。
⑦每孔各加2%红细胞1滴。
⑧振荡器上振荡一分钟，37℃温箱30分钟后判定结果。
5．判定标准：先检查对照孔，第5和第7孔应完全溶血为合格；第1~5排的第1~4孔中任一孔呈现不溶血则判该份待检抗原为阳性，其型别与所加标准血清的型别相同。
该法操作较繁琐，敏感性低，但特异强。
（三）口蹄疫酶联免疫吸附试验（ELISA）八十年代以来，国外常采用ELISA鉴定口蹄疫和猪水泡病病毒。
国内也有人试用该法对FMDV 和SDV进行检测，由于IgG的纯度不高，经常出现非特异性反应。