分子生物学实验方法与步骤(2)
分子生物学常用实验技术及方法
分⼦⽣物学常⽤实验技术及⽅法第⼆章常⽤实验技术及⽅法⼀、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl ，其中含有：模板DNA 0.5 µlPCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl10×MgCl 2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl⽆菌去离⼦⽔加⾄ 50 µl上层⽤25 µl 液体⽯蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退⽕1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
⼆、基于PCR 技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所⽰）；2. ⽤基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA ⽚段1，⽤基因3’端的Primer4和Primer 3⼀起PCR 扩增DNA ⽚段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA ⽚段1和DNA⽚段2；3. 以⽚段1和⽚段2为模板，进⾏第⼆次PCR反应，反应体系为50 µl：⽚段1 1 µl⽚段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O⾄50 µl在该反应体系中先不加⼊引物，按上述反应条件进⾏10个循环，然后再加⼊Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进⾏测序以确定定点突变的正确性。
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。
分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。
实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。
根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。
生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。
根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。
核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。
核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。
其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。
酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。
酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。
电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。
PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。
PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。
PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。
扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。
蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。
常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。
总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。
通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验报告
根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：
×100%
（4）醋酸纤维素薄膜电泳法分离测定RNA的四种碱基
1）RNA的碱水解：
称取0.20gRNA，溶于5ml 0.3mol/L KOH溶液中，使RNA的浓度达到20～30mg/ml。沸水浴加热30min。将水解液转入到锥形瓶中。冰浴，在冰浴过程中用高锰酸溶液滴定到水解液的PH值为3.5.在2500rpm离心10min。出去沉淀，上层液即是样品。
2）RNA基团鉴定和地衣酚法测定RNA含量的基本原理：
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸组分。
A：嘌呤鉴定：
嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。
H2SO4AgNo3
RNA嘌呤嘌呤银化物（白色或红棕色）
100℃
酵母含RNA 达2.67—10.0%，DNA 则少于0.03—0.516％。为此，提取RNA多以酵母为原料。
由于RNA得来源很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、稀碱法和浓盐法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的方法，次方法能够较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性，两种常见的方法原理为：
核糖定量反应：
RNA
HCl
93℃
4）使用电泳技术进行RNA鉴定的基本原理：
任何物质质点，由于其本身在溶液中的解离或是由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。一般来说，在碱性溶液中，分子带负电荷，在电场中向正极移动；而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。不同质点在电场中的移动速度不同，常用泳动度（迁移率）来表示。即带电质点在单位电场强度下的泳动速度。电泳快慢与电场强度、溶液的PH值、溶液的离子强度、电渗现象有关。
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表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。
7、2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%)的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制：ddH2O 1.4 ml30%储备胶0.33 ml1M Tris-HCl 0.25 ml10%SDS 0.02 ml10%AP 0.02 mlTEMED 2 μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。
（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三）电泳:在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。
（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。
（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。
室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。
现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。
必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。
正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。
所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。
目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。
可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备采用T7·Tag Affinity Purification Kit1．T7·Tag抗体琼脂。
2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
1. PEG 20000。
（二）操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。
包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。
将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
表达蛋白的生物学活性的检测一、MTT比色法检测细胞活性（一）原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。
对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中, 抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。