红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究
广西罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定
摘要 ： 发病罗非鱼 中分离 获得 ２ 从 株呈 １ ３ 溶血 的革 兰氏阴性 杆菌 ， 经细菌形态 、 培养 、 生理生化特性 初步鉴定为海 豚链球菌 ， 结合Ｐ Ｒ Ｃ 检测、 Ｃ 产 物核 苷酸序列测序及 ＢａｔＬ ＰＲ ｌ ｌ对分析 ， ｓ： 进一步确定该分离菌株为海豚链球菌 。 致病性试
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｏｐ ｔｏ ｅ ｉ ｂ ｃｅ ａ ｓ ａｎ ， ｒｍ— ｅａｉ ａ ｉ ｕ ｉ － ｅ ｌｓ ， ｅｅｉ ｌ ｅ ｏ ｉ ａ ｅ ｓ ｃ ： ｗ ａ ｇ ｎｃ ａ ｔ ｌ ｔ ｉｓ ａｇａ ｎ ｇ ｔ ｅ ｂ ｃｌ ｓｗ ｔ １ ｈ ｍｏ ｉ ｗ ｒ ｓ ａ ｄ ｆ ｍ ｄｓ ｓ ｄ ｒ ｈ ｉ ｒ ｒ ｖ ｌ ｈ３ ｙｓ ｏｔ ｒ ｅ
ｐ ｏ ｕ ｔ ａ ｄ ａ ａ ｙ ｉ ｆＮＣ ｌｓ ． ｅ ｒ ｓ ｌ ｆｐ ｔ ｏ ｅ ｅ ｉ ｅ ｔｉ ｄ ｃ ｔｄ ｔ ａ ｈ ｓ ｌ ｔｓ ｈ ｄ ｐ ｔ ｏ ｅ ｅ ｉ ａ ｄ ｃ ｕ ｄ ｒ ｄ ｃｓ ｎ ｎ ｌ ｓｓｏ ＢＩ ａ ｔ Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｏ ａ ｈ ｇ ｎ ｓｓ ｔｓ ｉ ａｅ ｈ ｔ ｅ ｉ ａｅ ａ ａｈ ｇ ｎ ｓｓ ｎ ｏ ｌ ｂ ｓ ｎ ｔ ｏ ｉｔｏ ｕ ｅ ｔ ｐ ｏ ｏ ｃ ｓ ｉ ｉ ａ ｏ ｉ ｐ ａ ｎ ｒ ｄ ｃ Ｓｒ ｔ ｃ ｃ ｕ ｎ ｎ ｆ ｔ ａ ｉ ．Ｄ ｕ ｅ ｓｔ ｉ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｓ ｌｔ ｓ ｗｅｅ ｈ ｇ ｌ ｅ ｓｔ ｅ ｏ ｅ ｌ ｒ ｇ ｓ ｎ ｉ ｖ ｔ ｅ ｐ ｒ ｎ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｔ ｅ ｉｏ ａｅ ｒ ｉｈ ｙ ｓ ｎ ｉ ｖ ｔ ｉ ｙ ｉ ｉ ｎ ｏ ｃ ｎ ｆ ｒｅ ｉｏ ， ｅ ｒ ｘ ｎ ， ｉ ｃ ｍｙ ｉ ， ａ ａ ｃ ｎ ｅ ｃ， ｕ ｒ ｓ ｎ ｉ ｖ ｏ ｎ ｒｌｘ ｃ ｎ ｇ ｎ ａ ｃｎ ｆ ｒ ｚ ｌ ｏ ｅ ｅ ｍｙ ｉ， ｏ ｆ ｎ ｃ ｌ ｃ ｆｉ ｏ ｅ ｌｎ ｏ ｃｎ ｋ ｎ ｍｙ ｉ ， ｔ． ｂ ｔ ｌ ｌ ａ ｗｅ ｅ ｉ ｅ ｓｔ ｅｔ ｏ ｆ ａ ｉ ， ｅ ｔ ｍｉ ｉ ， ｕ ａ ｏ ｉ ｎ ， ｎ ｉ ｏ ｄ ｓ ｅ ｔｍｙ ｉ ｎ ｅｒ ｃ ｃ ｉ ｅ ｅ ｃ ｔ ｐ ｏ ｃｎ ａ ｄ ｔ ｔ ｙ ｌ ， ｔ． ｒ ａ ｎ Ｋｅ ｒ ｓ ｔ ａ ｉ ； ｔｅ ｔ ｃ ｃ ｕ ｎ ｎ ；ｉ ｌ ｔ ｎ ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ： ｉ ｐ ａ Ｓｒ ｐ ｏ ｏ ｃ ｓｉ ｉ ａ ｓ ａｉ ； ｄ ｎ ｉ ａｉ ｌ ｏ ｏ ｉ ｆ ｏ
红鳍东方鲀精原干细胞鉴定、分离及纯化
nial, SG)和卵原细胞(Oogonia, OG)[14]。精原细胞包 括A型精原细胞、中间型精原细胞和B型精原细 胞[15], 而进行细胞移植的主要是A型精原干细胞, 即 精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)。与 PGCs相比, SSCs不仅同样具有自我更新、多能性 的干细胞特点和分化并发育为雌雄配子的潜力[16], 而且还具有细胞量大, 分离方法简易等优点。Okutsu等[17]利用SSCs移植技术路线制备出了虹鳟 YY“超雄鱼”并最终生产了全雄虹鳟苗种。星点东 方鲀与红鳍东方鲀同属东方鲀属, 其性成熟时间短 (10个月左右)、个体较小(10—15 cm)是红鳍东方 鲀的理想受体。以红鳍东方鲀精原干细胞为供体, 选择星点东方鲀雌鱼为受体, 利用精原细胞的性别 可塑性, 可以获得携带Y染色体的卵子, 这将降低红 鳍东方鲀亲鱼养殖成本, 而且也大大加速红鳍东方 鲀的选择育种工作, 缩短实现全雄苗种规模化生产 的周期。
关键词: 红鳍东方鲀; 精原干细胞; Percoll; 免疫荧光
中图分类号: Q172
文献标识码: A
文章编号: 1000-3207(2019)04-0797-08
红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)因其味鲜肉嫩, 营养价值高, 是我国北方海水鱼养殖的主要种类之 一[1]。相比红鳍东方鲀鱼肉, 俗称“白子”的雄鱼精 巢更是被人们视为珍品。由于养殖市场对雄鱼苗 种的需求, 科研工作者开始重视对其性别选择育种 尤其全雄化技术[2—6]。近十年来, 激素诱导性转化 在单性鱼制备中是一个十分有效并广泛采用的技 术[7]。本课题组已经通过17-β雌二醇成功诱导出伪 雌鱼, 待其性成熟后与天然雄鱼人工授精, 获得全 雄苗种的父本来源——“YY”超雄鱼, 最终实现全 雄苗种规模化生产。但是红鳍东方鲀需要3年才能 达到性成熟, 而且亲鱼个体较大(体重2—5 kg), 需 要大量的时间和空间来保存亲鱼。因此通过激素 诱导最终获得全雄苗种的选择育种技术存在养殖 成本高的问题。
海豚链球菌
Fish
脑膜炎和全眼球炎 高发病率和死亡率
Bromage and Owens, 2002
Humans
蜂, 1997; Lau et al.,2003; Facklam et al., 2005
Pathophysiology
侵袭宿主细胞
黏附并侵袭宿主细胞 对宿主吞噬细胞具有亲和性
Human, Canada (Goh et al., 1998) Reef fish, Caribbean basin (Ferguson et al., 2000)
Tilapia and trout, Israel (Eldar et al., 1994) Middle East Rabbitfish, Bahrain (Yuasa et al., 1999) Rabbitfish, Singapore (Foo et al., 1985)
Prevention and therapy
Introduction
日本首次证实链球菌 能够侵袭危害养殖鱼 类虹鳟 (Hoshina et al.)
链球菌属细菌对鱼类的危 害凸显，海豚链球菌成为 全球重要的鱼类病原菌
19世纪 50年代
1958年
1976年
20世纪 90年代
链球菌并非鱼 类主要致病菌
多种特异基因编码
的毒力因子决定着 海豚链球菌致病性
致病株与非致病株PFGE图谱
(Weinstein et al., 1997)
Pathophysiology
2001年Fuller et al.根据Weinstein et al.的结果，比较了 海豚链球菌致病菌株与共生菌株间致病力的差异
小鼠皮下感染模型
体为基础的
间接免疫荧
罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定及药敏试验
罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定及药敏试验陆英杰;赖达光;田鑫江;于辉【摘要】为明确广东佛山某罗非鱼鱼场暴发疑似链球菌病的病原情况,应用脑心浸液培养基、胰蛋白大豆琼脂培养基对患病罗非鱼的肝、胆组织进行细菌分离,对获得的革兰氏阳性链球菌应用16S rDNA引物进行基因序列鉴定,并对被确定的链球菌进行基因进化分析,同时进行阿奇霉素、链霉素、阿米卡星等10种抗生素的药敏试验.结果表明,分离获得革兰氏阳性链球菌1株,经16S rDNA基因扩增鉴定为海豚链球菌;基因进化分析显示,该菌与海豚链球菌和禽的副乳链球菌亲缘关系最近;药敏试验结果显示,该菌对阿奇霉素和头孢噻肟中度敏感,对其他抗生素不敏感.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)007【总页数】4页(P110-113)【关键词】罗非鱼;海豚链球菌;分离鉴定;药敏试验【作者】陆英杰;赖达光;田鑫江;于辉【作者单位】佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200;佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200;佛山市南海百容水产良种有限公司,广东佛山528232;佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200【正文语种】中文【中图分类】S917.1罗非鱼是原产于非洲的一种热带中小型鱼类，因其具有食欲广、适应性强、生长快、繁殖力高等优点，成为联合国粮农组织推荐的养殖品种，目前已被世界各地广泛引种并养殖。
我国是世界上最大的罗非鱼养殖地，罗非鱼也是我国出口的主要养殖品种之一，罗非鱼产业对于我国乃至世界食物供应、增加就业机会以及促进国际贸易等均具有十分重要的意义 [1-2]。
然而，近年来罗非鱼病害的发生逐渐成为我国罗非鱼产业的主要制约因素，且危害呈越发严重的趋势，其中鱼类链球菌是造成鱼类养殖业经济损失的重要致病菌[2-3]。
链球菌（Streptococcus spp.）是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，是人类的重要病原之一，可引起败血病、肺炎及脑膜炎等疾病，同时也是其他多种脊椎动物包括猪、牛、鱼等的重要病原菌。
养殖鱼类链球菌病病原的分离鉴定及其16SrDNA分析
野 外 分 离 株 Ｈ ．、 Ｈ 一、ＨＤ３ Ｄ４ 和 Ｄ １ Ｄ２ ．、Ｈ Ｈ ．０均 采 自广 东省 惠东 县盐 洲镇海 水 网箱养 殖 鱼 Ｄ５ 类 。Ｈ 一 Ｄ １采 自 花 尾 胡 椒 鲷 （ ｌｔｒｙｃｕ ｉ — Ｐｅｏｈｎｈ ｓｃ ｃ ｃ ｎ ｔｓ ，Ｈ 一，Ｈ 一 自平 鲷 （ 口 ｓｒａ ，Ｈ ． ｕ） Ｄ２ Ｄ３采 ａｂ ） Ｄ ４采 自布 氏 石 斑 （ ｐｎｐｅ ｓｂ ｅｅ ） Ｅ ｉｅｈｌ ｌ ｋｒ ，ＨＤ５ ｕ ｅ ｉ ．０采 自卵形 鲳够 （ ｒｃｉ ｔｓ ｖｔ ） Ｔａｈｎ ｕ ａｕ 。 ｏ ｏ ｓ
养殖鱼类分离获得 的几株链球菌进行病原学鉴定。
１ 材料 和方法
１ １ 菌株 ．
Ｌｃ ｃｃ ｓ ａｖａ ａｔ ｏｃ ｒｅｅ等 Ｊ ｏ ｕｇ ｉ 。这 些 病 原 菌 所 引 发 鱼 类 的败血症 、脑 脊膜 炎等病 症表现 非常 相似 ，并且 在 菌落 、菌体形 态 上很 难 辨 别¨ＩＪ 其 中 ，５ ２。 ． 一
１２ 病 原 的分离 、培 养 ．
皮 下脓肿 中分 离 获 得 Ｊ 。该 病 原 菌 能 广 泛 感 染 罗 非 鱼 、虹 鳟 、鲷 科 鱼 类 、石 斑 鱼 、鲕 鱼 等 多种 淡 、 海水 鱼类 ，是养 殖鱼类 的重要 病原 菌 ¨ 』 ，但 它在 链球 菌属 中较 为特 殊 。它不 能 用 传 统 的 Ｌｎｅ ｅ ａｃｆｌ ｉｄ 链球 菌血 清 型 对 其 进 行 分 组 ，而 且 不 同 的地 理 株 系在生 化 特 性 上 存 在 差 异 Ｊ ，以 致 曾被 鉴 定 为
规生化结果表明 ，其 中 ４株 即 Ｈ 一 、Ｈ 一、Ｈ 一 Ｄ １ Ｄ２ Ｄ ３和 Ｈ － Ｄ ４为海豚链球菌 （ｔｐｏｏｃｓｉｉ ） Ｓｒ ｔ ｃｕ ｎ ｅ ；另外 １ 即 Ｈ 一 ｅ ｃ ａ 株 Ｄ ５ ０为停乳链 球菌 （ｔｐｏｏｃ ｙｇ ｌｃａ ） Ｓｒ ｔ ｃｕ ｄｓａ ｔ ｅ 。分别对上述分离菌株 的 １Ｓｒ Ｎ ｅ ｃ ｓ ａｉ ６ Ａ进行 Ｐ Ｒ扩增 和测序 ，并与 Ｎ — Ｄ Ｃ Ｃ
致病性海豚链球菌的分离鉴定及防控中草药的筛选
近年来，大黄鱼致病病原体的种类呈上升趋势，病原复杂性增加，发病率上升，病情严重。
这些问题严重影响了大黄鱼养殖户的收益，对大黄鱼养殖产业的健康发展造成了巨大挑战。
宁波市某大黄鱼养殖场出现鱼体大批量死亡，笔者对病鱼进行采样后，利用革兰氏染色、分子鉴定技术探究了大黄鱼致病的主要原因，利用药敏实验以及中草药筛选技术进行了致病菌的防控策略探索。
本研究可为养殖大黄鱼细菌性疾病的诊断和防治提供有益的参考。
一、材料与方法1.发病背景及实验材料2021年8－9月，某养殖场大黄鱼出现大规模持续发病，病鱼出现摄食减少、游动迟缓、水面打转等现象；其体表溃疡出血、烂尾、眼球突出、浑浊；解剖可见鳃出血、脾脏肿大、有腹水。
体表及鳃组织水晶片并未观察到明显寄生虫。
为明确发病原因，笔者采集患病大黄鱼肝、脾、肾和脑组织划线接种于脑心浸液琼脂培养基进行细菌分离、采集优势菌株。
2.菌悬液制备及PCR鉴定将采集的菌种接种到脑心浸液琼脂平板上，37℃下培养24小时。
然后，从培养基上挑选单个菌落，转移到液体培养基中。
在28℃、180转/分的条件下，摇床培养24小时，调整菌液浓度至(2～3)×108CFU/毫升，用于后续实验。
水浴锅99℃预热，在超净台中取灭菌EP管，加入100微升双蒸馏水，挑取单菌落加入EP管中，EP管置于水浴锅加热10分钟，冰浴5分钟，6000转/分下离心2分钟，上清液为待测产物。
采用16S通用引物(上游引物序列为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增检测。
PCR体系为：12.5微升Taq master Mix；9.5微升重水；1微升上游引物，1微升下游引物；2微升待测上清液。
PCR反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒、35个循环；72℃2分钟。
所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送至杭州有康生物科技有限公司测序。
海豚链球菌
Fish
脑膜炎和全眼球炎 高发病率和死亡率
Bromage and Owens, 2002
Humans
蜂窝组织炎 脑膜炎
Weinstein et al., 1997; Lau et al.,2003; Facklam et al., 2005
Pathophysiology
侵袭宿主细胞
黏附并侵袭宿主细胞 对宿主吞噬细胞具有亲和性
Parrot fish Red drum Chubb Barramundi Barramundi cod Gold spot cod
Grey mullet Channel catfish Lizard fish Rabbitfish Ayu 银鼓鱼 Coho salmon Amago salmon 大泷六线鱼 Rainbow trout Japanese flounder Yellowtail Puffer fish Amazon freshwater dolphin Flying fox Human
Distribution
North America
Middle East
Asia-Pacific
Distribution
Dolphin, USA (Pier and Madin, 1976) North America
Tilapia hybrids, USA (Perera et al., 1994)
Distribution
首次报道养殖鱼类海豚链球菌病 在以色列爆发海豚链球菌病之后
通过进口以色列 目前有关鱼类海豚链球菌在不同地域间 罗非鱼产品输入
America Israel 进行传播的方式尚不清楚，不知是通过
海洋水流还是国家之间水产品的进出口 进口的亲鱼产卵
红拟石首鱼海豚链球菌分离_鉴定及致病性研究_沈智华
收稿日期:2004-03-02;修订日期:2005-05-30基金项目:浙江省自然科学基金(Y3004425)资助作者简介:沈智华(1965)),女;高级工程师;主要从事水产病害防治研究。
浙江省淡水水产研究所沈锦玉、尹文林、刘问,浙江省海洋水产研究所许源剑、张学舒、史海东、楼宝等在试验中给予了热情帮助,谨致衷心感谢!E -mail:zjsz h@通讯作者:邵健忠(1963)),男,教授;博士生导师;E -mail:lscs haoj@红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究沈智华1,2钱 冬2 许文军3 顾金华4 邵健忠1(11浙江大学生命科学学院,杭州 310012;21浙江省淡水水产研究所,湖州 313001;31浙江省海洋水产研究所,舟山 316100;41湖州市中心医院,湖州 313000)摘要:2001年9月)12月,浙江舟山部分网箱养殖红拟石首鱼发生了陆续死鱼,发病鱼表现为眼球突出、浑浊,失去方向性,皮肤溃疡等症状。
从病鱼的肾脏和肝脏中分离到菌株SO -2和SO -3,对两分离株进行了致病性试验,发现两者对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠均有致病力,SO -2和SO -3对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠的LD 50分别为418@108C FU/尾和119@107C FU/尾、218@108CFU/尾和813@107CFU/尾及916@106CFU /只和412@106CFU/只,试验感染鱼出现眼球突出、浑浊及失去方向性等与自然发病相似症状,确定该两株菌为致病菌。
两分离株为革兰氏染色阳性,呈链状球菌,B 溶血,10e 生长,45e 不生长;接触酶阴性,水解七叶灵、精氨酸;VP 试验、脲酶和马脲酸试验阴性,发酵葡萄糖、水杨苷、蔗糖和淀粉,不发醇阿拉伯糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖和山梨醇。
分离株对氨卞青霉素、万古霉素和先锋Õ等高度敏感,对庆大霉素、复方新诺明、林可霉素、氟哌酸等不敏感。
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出现白片状花纹 。无菌操作取濒死病鱼肝脏 、 肾脏 组织 ,于 TCBS 、 TSA 和自制肝浸液平板培养基 , 自制 肝浸液采用草鱼肝脏为原料 ,制备方法参考文献[1 ] ,
28 ℃宜培养 用接种环沾取纯培养菌液 ,
箱和池塘中广泛养殖 。然而 , 随着养殖规模的扩大 和放养密度的提高 , 红拟石首鱼的病害发生日趋频 繁 ,浙江省网箱养殖中 , 每年 7 月 — 12 月均有病害 发生 ,并造成较大损失 。2001 年 12 月对舟山某网箱 养殖中发病红拟石首鱼进行了病原分离 , 随后对分 离株进行了生理生化特性和致病性分析以及菌株的
(11 浙江大学生命科学学院 ,杭州 310012 ;21 浙江省淡水水产研究所 ,湖州 313001 ; 31 浙江省海洋水产研究所 ,舟山 316100 ;41 湖州市中心医院 ,湖州 313000)
摘要 :2001 年 9 月 — 12 月 ,浙江舟山部分网箱养殖红拟石首鱼发生了陆续死鱼 ,发病鱼表现为眼球突出 、 浑浊 ,失去 方向性 ,皮肤溃疡等症状 。从病鱼的肾脏和肝脏中分离到菌株 SO22 和 SO23 , 对两分离株进行了致病性试验 , 发现 两者对红拟石首鱼 、 罗非鱼及小白鼠均有致病力 ,SO22 和 SO23 对红拟石首鱼 、 罗非鱼及小白鼠的 LD50 分别为 418 ×
红拟石首鱼 ( Sciaenops ocellatus ) , 又名美国红 鱼、 红姑鱼 ,属鲈形目石首鱼科 , 原产于北大西洋沿 岸及墨西哥湾 ,因其肉质细嫩 、 生长快 、 广温 、 广盐等 优点 ,而成为迄今世界上养殖产量最高的鱼种之一 。
1991 年引进 ,1995 年繁殖成功 , 现已在沿海各地网
PCR 鉴定等研究 ,现将结果报道如下 。 1 材料与方法 111 菌株分离 由舟山某渔场提供的二龄患病红
分别接种于 TSA 、 普通肉汤琼脂 、 BHI 琼脂平板 , 于
28 ℃ 下培养 ,观察 24h 和 48h 后菌落生长情况 ; 将纯
培养菌液分别接种于 TSB 、 普通肉汤 、 BHI 液体试管 中 ,于 28 ℃、 180r/ min 培养 ,24h 后测 OD560 值 , 根据 公式 : 菌浓度 = ( 1817587 × OD560 - 017334) × 稀释倍 数 [2 ] ,确定菌浓度 。用接种环沾取纯培养菌液 ,接种 于 TSA 平板 , 分别于 10 ℃、 15 ℃、 20 ℃、 28 ℃、 37 ℃ 和
物经涂片和染色后 ,在显微镜下观察可见球形细胞呈 长短不一的链状排列。革兰氏染色呈阳性 (图 1) 。
散法 。所用药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限 公司 。 117 分离菌对红拟石首鱼的致病性试验 在浙江 省海洋水产研究所西闪试验场进行。试验用红拟石 首鱼购自舟山某网箱养殖点 ,规格为 100 — 120g/ 尾 。 于室内暂养 1 周后进行菌株致病性试验 。用无菌生 理盐水将纯培养菌液稀释至 410 × 109 、 410 × 108 、 410 7 6 5 × 10 、 410 × 10 、 410 × 10 CFU/ mL , 腹腔注射 014mL/ 尾 ,同时设注射生理盐水组为对照 。试验期间水温 为 24 — 27 ℃, 对死亡鱼进行肾脏细菌分离 , 致病性 试验的结束时间以不再发生死亡为止 , 半数致死剂 [4 ] 量 LD50以 Reed2Muench 法计算 。 。 118 分离菌对罗非鱼的致病性试验 试验于室内 水泥池内进行 。试验用罗非鱼购自浙江省淡水水产 研究所特种苗种基地 , 规格为 55 — 65g/ 尾 。于曝气 自来水中暂养 7d 后试验 。用无菌生理盐水将纯培 养菌液稀释至 315 × 109 、 7× 108 、 114 × 108 和 218 × 107 CFU/ mL , 腹腔注射 012mL/ 尾 , 并设生理盐水对 照 ,水温控制在 24 — 26 ℃。致病性试验的结果观察 与分析方法同上 。 119 分离菌对小白鼠的致病性试验 试验小鼠购 自浙江省医学科学院实验动物中心 , 规格为 20 — 23g/ 只 。纯培养菌液以生理盐水稀释至 510 × 108 、
014mL/ 只 ,并设生理盐水对照 。试验观察与分析方
680
水 生 生 物 学 报
表1 分离菌株生化特性鉴别结果
Tab. 1 Physio2biochemical characteristics of two isolates
29 卷
参考株 3 检测项目 Item
+ + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + -
+ + + + -
接触酶 Catalase
615 %NaCl
为 : 挑取 TSA 培养单菌落于 1mL011mol/ LTE (pH714) 缓冲液中 ,充分振荡 ,8000r/ min 离心 5min ,取沉淀用 μ μ μ 100 LTE 重悬 ,取 2 L 用于 PCR 扩增 。50 L PCR 反 应体系中 ,分别加入 Taq 酶 2u ( Promega 公司 ) 、 10 × μ μ 缓冲液 5 L、 MgCl25 L、 引物各 10pmol/ L 以及 dNTP ( Takara ,215mmol/ L ) 8 μ L ,用双蒸水补足反应体积 ; 反 应条件为 94 ℃变性 3min 、 再 94 ℃ 1min 、 55 ℃ 1min 、 72 ℃ 115min , 共 进 行 35 次 循 环 , 最 后 72 ℃延 伸 μ 10min 结束反应 , 取反应液 8 L 经 2 % 琼脂糖电泳 (90V ,90min) 后观察结果 。标准分子量对照为 100bp Ladder ( Takara) ;BioRad GelDoc2000 扫描并记录结果 。
收稿日期 :2004203202 ; 修订日期 :2005205230 基金项目 : 浙江省自然科学基金 ( Y3004425) 资助
色 ,显微镜观察 。
114 生化特性测定 采用琼脂平板和生化鉴定管
等方法 ,分别测定两株菌的溶血 、 生长 、 水解活性 、 酶
) ,女 ; 高级工程师 ; 主要从事水产病害防治研究 。浙江省淡水水产研究所沈锦玉 、 作者简介 : 沈智华 (1965 — 尹文林 、 刘问 , 浙江省海洋水产
108 CFU/ 尾和 119 × 107 CFU/ 尾 、 218 × 108 CFU/ 尾和 813 × 107 CFU/ 尾及 916 × 106 CFU/ 只和 412 × 106 CFU/ 只 , 试验感染
鱼出现眼球突出 、 浑浊及失去方向性等与自然发病相似症状 , 确定该两株菌为致病菌 。两分离株为革兰氏染色阳 性 ,呈链状球菌 β , 溶血 ,10 ℃ 生长 ,45 ℃ 不生长 ; 接触酶阴性 ,水解七叶灵 、 精氨酸 ;VP 试验 、 脲酶和马脲酸试验阴性 , 发酵葡萄糖 、 水杨苷 、 蔗糖和淀粉 ,不发醇阿拉伯糖 、 菊糖 、 乳糖 、 蜜二糖 、 棉子糖和山梨醇 。分离株对氨卞青霉素 、 万古霉素和先锋 Ⅴ 等高度敏感 ,对庆大霉素 、 复方新诺明 、 林可霉素 、 氟哌酸等不敏感 。应用 16SrRNA 基因进行的 菌株 PCR 鉴定 ,确定该两株菌为海豚链球菌 。 关键词 : 红拟石首鱼 ; 海豚链球菌 ; 致病性 ; 鉴定 中图分类号 :S941142 文献标识码 :A 文章编号 :100023207 (2005) 0620678206
116 药物敏感性试验 采用药敏纸片琼脂平板扩
体培养基 。两株菌在 28 ℃、 37 ℃ 下生长良好 ,20 ℃ 下 生长较慢 , 菌落较小 ,15 ℃下生长很慢 ,24h 时菌落 极微小 ,10 ℃下 96h 时肉眼可见针尖大小的菌落 ,
45 ℃ 下不生长 。 213 病原菌的鉴定 21311 菌体形态显微观察 SO22 和 SO23 液体培养
45 ℃ 下培养 ,观察 24h 和 48h 菌落生长情况 。 113 病原形态观察 单菌落接种于 BHI 液体试管 , 28 ℃ 培养 18h 后取菌液 , 经涂片 、 固定和革兰氏染
拟石首鱼 , 体长 20 — 32cm , 体重 300 — 600g 。病鱼体 表皮肤多处溃疡 , 眼球突出 、 色混浊或发白 , 多血色 腹水 ,脾肿大或萎缩成黄绿色 , 部分病鱼肝脏失血 ,
510 ×10 、 510 ×10 和 510 ×10 CFU/ mL , 腹腔注射
7 6 5
图1 分离菌 SO22 的显微形态
Fig. 1 Micrograph of the isolate SO22 ( × 1000)
21312 分离菌的生理生化特征 两株菌均为β 溶
血 ;10 ℃生长 ,45 ℃不生长 ; 接触酶阴性 ; 水解七叶 灵、 精氨酸 ,VP 试验 、 脲酶和马脲酸试验阴性 ; 发酵 葡萄糖 、 水杨苷 、 蔗糖和淀粉 , 不发酵阿拉伯糖 、 菊 糖、 乳糖 、 蜜二糖 、 棉子糖和山梨醇 。详见表 1 。 214 分离菌株的 PCR 鉴定 分离菌株 16SrRNA 基因的 PCR 产物琼脂糖凝 胶电泳结果见图 2 。由图可见 , 分离菌株 SO22 和 SO23 经海豚链球菌种特异性引物扩增 , 产生了预期 300bp 的特异产物 , 符合海豚链球菌 16SrRNA 基因 的分子特症 。 215 药物敏感性试验 结果表明 ,庆大霉素 、 复方新诺明 、 林可霉素 、 氟 哌酸 、 丁氨卡那 、 卡那霉素等 6 种抗生素对两株菌完 全无抑制效果 ,但两分离株对氨卞青霉素 、 万古霉素
研究所许源剑 、 张学舒 、 史海东 、 楼宝等在试验中给予了热情帮助 ,谨致衷心感谢 ! E2mail :zjszh @163. com
) ,男 ,教授 ; 博士生导师 ; E2mail :lscshaoj @mail . hz. zj . cn 通讯作者 : 邵健忠 (1963 —