抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶
S O D P O D C A T活性测
定方法
集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液
（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na
2HPO
4
·12H
2
O（分子量
358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH
2PO
4
·2H
2
O（分子量
156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na
2HPO
4
)
228.75ml，B母液(NaH
2PO
4
) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

（3）100μM EDTA-Na
2溶液：取0.03721gEDTA-Na
2
用磷酸缓冲液定
容至1000ml。

（4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。

（5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

2、酶活性测定
（1）取10ml试管（要求透明度好）
测试管：分别依次加入3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met ）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT ）溶液+0.5ml EDTA-Na 2溶液+0.4ml 蒸馏水(混合后摇匀)+0.1ml 酶液+0.5ml 核黄素溶液；
对照管（2个）：分别依次加入3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met ）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT ）溶液+0.5ml EDTA-Na 2溶液+0.5ml 蒸馏水(混合后摇匀) +0.5ml 核黄素溶液；其中1支试管照光后测定作为最大光还原管，另1支置于暗中测定时用于调零。

（2）将一支对照管置于暗处，其余试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min ；
（4）以不照光的对照管调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u ）。

SOD 总活性＝ [( A ck -A E )×V]/（1/2A ck ×W×Vt） SOD 比活力＝SOD 总活性/蛋白质含量
SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck 为照光对照管的吸光度；A E 为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml ，加入PBS 的体积)；Vt 为测定时的酶液用量（ml ，30ul ）；W 为样品鲜重（g ，测定时应换算为叶绿体的质量mg ）；蛋白质含量单位为mg/g 。

二、POD 、CAT 酶活性的测定
粗酶液制备同SOD 。

1、
过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法） （1）试剂配制：
100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A 母液(Na 2HPO 4 ) 6.15ml 和
B 母液(NaH 2PO 4 ) 43.85ml 混匀即为100ml PBS ；
（2）反应混合液配制（以24个样为准）：
取75ml PBS(100mM ，pH6.0)，加入42ul 液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入28.5ul 30％的H 2O 2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：
空白对照：3ml 反应混合液+1ml 蒸馏水，作为对照调零； 测试管：3ml 反应混合液+1ml 酶液，立即开启秒表；
测定OD470值（测定40秒），每隔30s 读一次数。

读四分钟,共8次。

（4）酶活性计算：以每min OD 值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u ）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml ，(1.6ml ）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml ，30ul ）。

2、
过氧化氢酶（CAT ）活性测定 （1）试剂配制：
0.15mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）：取A 母液(Na 2HPO 4) 457.5 ml 和
B 母液(NaH 2PO 4) 292.5 ml 混合后用蒸馏水定容至1000ml 。

（2）反应液配制：取200ml PBS （0.15M ，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H 2O 2（原液）摇匀即可。

（3）样品测定：取3ml 反应液加入0.1ml （可视情况调整）酶液，以PBS 为对照调零，测定OD240（紫外）（每隔5s 读一次数，测定1min ）。

（4）酶活性计算：以每min OD 值减少0.01为1个酶活性单位（u ）。

CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml ， 1.6ml ）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml ）。

五、丙二醛含量的测定 1、试剂配制：
10%TCA ：100g 三氯乙酸 → 1L
0.67%TBA ：3.35g 硫代巴比妥酸 → 500ml 10%TCA （避光） 2、测定步骤:
0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷却，离心→上清OD 450，OD 532，OD 600 3、计算组织中MDA 含量：
MDA 浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA 含量(umol/g FW)=C ×V/W
式中V 为提取液体积(1.6ml)，W 为样品鲜重(0.2g)。

六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）
（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g ，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml 大离心管）中，加10ml 去离子水，在室温下放置3h 使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；
（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min 以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；
（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还可以计算植株伤害程度：
伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%。