定量PCR的实验流程及注意事项
荧光定量PCR-实验步骤
荧光定量PCR检测MMP-2 mRNA的表达一、提取细胞总RNA(一)材料准备1.注意事项（1）RNA酶广泛存在于人体表面和环境中，戴口罩，勤换手套，避免皮肤与实验器具接触；专门的RNA操作区，保持清洁，定期消毒离心机，移液器均应专用。
（2）注意冰上操作，低温离心，实验所需试剂均应-4℃冰箱中预冷处理。
（3）所有实验器皿，材料都要经过去RNA酶处理，所需的氯仿、异丙醇、乙醇等都确保没有被RNA酶污染。
如果发现有污染，立即更换。
（4）操作人员保证操作的准确性，避免人为产生误差和偏倚。
2.实验器具处理：（1）塑料制品：包括枪头、EP管等，尽量使用一次性塑料制品。
若已表明为RNase-free 制品，且没有开封使用过，不需要再处理。
去除RNA酶处理步骤为：玻璃烧杯中加三蒸水和DEPC使其终浓度为0.1%（DEPC二乙基焦碳酸酷为剧毒物，通风橱中小心使用），将待处理的塑料制品逐个浸泡入DEPC水中，保证塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风橱中室温下处理过夜，取出后尽量控干其中液体，高压后烘干，置洁净处备用。
（2）玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净后0.1%DEPC-H20浸泡过夜，烤干备用。
(二)试剂配制1.DEPC水：吸取1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配制成0.1%DEPC水，充分搅拌混匀后分装，备用。
2.75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水（高压灭菌处理后的DEPC水）按比例配制，-4℃冰箱保存备用。
3.异丙醇：DEPC水处理过的棕色瓶中保存。
4.氯仿：DEPC水处理过的棕色瓶中保存。
(三)实验操作步骤1.标本收集根据实验设计，给予不同浓度的药物作用于人卵巢癌SKOV3细胞24h，观察MMP-2 mRNA表达的变化。
按实验要求收集样本，分别提取细胞的总RNA。
2.Trizol法提取细胞总RNA（1）吸除6孔板中的旧培养基，使用PBS清洗2次。
（2）吸除PBS，每孔加入0.9ml RNA裂解液(Trizol)，轻轻平晃板身,使裂解液覆盖底面与细胞充分接触并完全裂解细胞。
PCR操作过程中的注意事项
PCR操作过程中的注意事项PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。
在进行PCR实验时，需要特别注意以下几个方面，以确保实验的成功和准确性。
实验室准备在进行PCR实验之前，需要准备一个干净整洁的实验室环境。
实验台面和操作工具应经过彻底清洁和消毒，以防止外源性污染。
此外，实验室应具备相应的PCR工作区，以便进行样品准备、试剂配制和扩增反应。
样品处理在处理样品前，应注意避免自身和外源性DNA污染。
实验人员应保持良好的个人卫生习惯，并佩戴手套、口罩和实验外套。
样品处理区应与其他区域隔离，并使用专门的试剂和工具，以防止交叉污染。
反应管选择和处理选择高质量的PCR反应管以确保准确的结果。
反应管应具有良好的耐热性和密封性。
在使用反应管之前，应检查是否有破损或污染。
使用无RNase/DNase酶的反应管，并在实验过程中避免接触皮肤和外源性RNA/DNA。
试剂配置和操作PCR试剂应根据厂家说明进行配置和操作。
重量和体积的测量应精确，并使用纯净的洗净水或无核酸酶的溶剂溶解试剂粉末。
如有需要，可以使用过滤器或离心机去除可能的污染物。
扩增反应条件PCR反应的成功与否取决于反应条件的优化。
实验人员应根据模板DNA的特性和扩增片段的大小选择合适的引物、试剂浓度和温度。
为了避免非特异性扩增，温度梯度PCR或优化的程序温度是必不可少的。
工作流程严谨在进行PCR实验时，应遵循严谨的实验流程。
准确记录每一步操作，包括试剂配制、样品处理、扩增反应条件和时间。
要尽量避免温度变化和长时间暴露，以防止DNA 降解和酶的活性损失。
阴性对照和负对照为了排除污染、引物非特异性扩增和假阳性的可能，实验中应设置阴性对照和负对照。
阴性对照是在反应中添加无模板DNA的反应管，负对照是在反应中不添加任何试剂。
通过与实验组的对照组比较，可以确定实验结果的准确性。
PCR产物处理在PCR反应后，应根据实验目的选择合适的PCR产物处理方法。
可以通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切、测序等技术进行PCR产物的检测和分析。
定量PCR之操作流程与注意事项
定量PCR之標準作業流程（SOP）與注意事項1.所有準備進行定量PCR分析之RNA樣本必須全程儲存於-80度C，以確保total RNA的完整性；2.本實驗流程中採用QIAGEN RNeasy Mini - RNA Purification Kit （Cat No.74104與74704）進行total RNA純化，詳細實驗步驟請見動物組織細胞total RNA萃取-For Liver與動物組織細胞total RNA萃取-For Muscle & Heart Tissue；3.純化出之total RNA，會依據組織種類之RNA含量差異，利用DEPC H2O進行不同程度之稀釋（liver：60X，muscle：15 X，heart： 15X），由於微量石英分析管最小分析體積為90 μl，因此各個樣本之稀釋體積總量為90 μl（60 X =3 μl + 177 μl [再由180 μl取出90 μl進行分析]，15 X = 6 μl + 84 μl）；4.稀釋後之RNA樣本將以微量石英分析管在分光光譜儀(spectrophotometer)讀取特定波長紫外光 [UV光：260 nm/ 280 nm] 之光學密度 (optical density，O.D.)進行核酸定量，O.D. 260 nm數值最好介於0.1~1之間，而純度較佳之RNA樣本的260 nm/ 280 nm 的比值最好介於1.6~2.0之間（若>2.0表示有酒精殘留，若<1.6表示有protein污染）；5.計算原始樣本RNA濃度之算法：原始樣本RNA濃度=O.D. 260 nm 數值× 40× 稀釋倍數P.S. 1 O.D.之260 nm值 =40 μg/ml 的 total RNA6.若初次使用的RNA萃取Kit，可以使用Formaldehyde Argarose Gel進行電泳，針對萃取出來的RNA進行品質監控（Quality Contro l，QC），詳細實驗步驟請見Formaldehyde-gel electrophoresis；7.計算出各個樣本1 μg之total RNA的體積；8.準備反轉錄（reverse transcriptase）的試藥組（iScript TM cDNA Synthesis Ki t，Cat# 170-8890，BioRad），該kit的每一個reaction可將1 μg 的total RNA反轉錄成2 μg之cDN A，故需準備1 μg之total RNA供反轉錄使用；下表示操作1個reaction的反轉錄反應之試劑組成與incubation時間（加入reagent的順序：RNase free waterÆRNAÆReaction mixÆTranscriptase）；P.S.反應結束後cDNA可以保存於4/ -20/ -80度C當中均可9.當反轉錄反應完成所得到之cDNA可以進行儲存或直接進行定量PCR反應之用；10.進行定量PCR實驗時，首先需將所要分析基因之primer（包含：reverse與forward）與TaqMan Probe準備完畢；11.TaqMan Probe Preparation（儲存與操作時需要使用避光容器）：(1)TaqMan Probe為凍乾粉末，因此必須使用滅菌過濾的ddH2O將粉末溶解；(2)溶解probe時先看廠商的資料，確定內部粉末的mole數，稍後將內部粉末全部溶解成10 μM的濃度；(3)溶解後的probe務必使用避光的褐色tube管進行分裝，以避免probe被重複回溫影響品質（每管50 μl，並標號，請依序使用）；(4)由於TaqMan Probe上有conjugate螢光dye，因此在溶解凍乾粉末的過程當中，務必使用pipette進行mi x，千萬不可以!進行vortex；(5)配製範例：若有一probe其含量為5 nmol公式為：mole數/體積(L)=M5 nmol/V(L)=10 μMV(L) = 5 × 10 -4 (L)= 0.5 ml = 500 μlÆHin t：在5 nmol的數字後加兩個0，單位為μl，即為加入的水量(6)在25 μl Supermix中的Probe最終濃度為300 nM，則須加入多少體積之10μM的Prob e，可得到300 nM的最終濃度？<Ans> 300 nM = 0.3 μMM1× V1 = M2× V210 μM × xμl = 0.3 μM × 25 μlÆ x = 0.75 μl12.Primer Preparation(1)我們所購買的Primer之原始濃度均為100 μM，因此我們會先由stock中抽取10 μl的Primer加入90 μl滅菌過濾的ddH2O，將原液稀釋成10 μM，並利用此稀釋Primer進行PCR反應之操作；(2)在25 μl Supermix中的Primer最終濃度為400 nM，則須加入多少體積之10 μM的Primer，可得到400 nM的最終濃度？<Ans> 400 nM = 0.4 μMM1× V1 = M2× V210 μM × xμl = 0.4 μM × 25 μlÆ x = 1 μl13.序列稀釋的方法（用於測試每個新設計的基因Probe與Primers在進行PCR反應時的Efficiency與Concentration Dynami c，並做出Standard Curve，作為後續分析之用）(1)一般製作standard curve時，至少會需要有4個不同稀釋倍數的樣本，所以採用的濃度大約會是在102 X~ 105 X之間，每個稀釋樣本間的差距為10倍（若樣本濃度真的太稀，也可使用5倍間距的稀釋倍數）；(2)製作cDNA的序列稀釋樣本時，會先由原始樣本取出10 μl的sample加入90 μl的滅菌過濾的ddH2O中先行稀釋10倍，之後以該10倍稀釋樣本為原液，連續作四次的10倍稀釋，並以最終稀釋倍數為102 X~ 105 X間的四個樣本作為序列稀釋的操作樣本；(3)進行序列稀釋時，須注意每次抽取10 μl的樣本前，務必將該樣本vortex完全並進行spin down的動作（操作核酸時，因為單股核酸帶負電，會黏合在tube管壁上），以確保序列稀釋的資料準確性；(4)詳細操作流程請見下圖；14.操作Real Time – PCR之詳細步驟與方法(1)配製iQ Supermi x（Cat#170-8860 ，BioRad），用於進行PCR反應之用，Supermix含有PCR反應所需的dNTPs、buffer、鎂離子等，當Supermix與cDNA template混合後（請勿vortex，內有DNA polymerase），即可放入Real time PCR機器進行分析；(2)一般而言，我們會將Supermix減半使用以節省reagent與sample，一個基因的一個reaction所需的體積是20 μl（不包含5 μl 之cDNA template），所以要進行PCR反應之前，以單一基因為單位，可以先進行估算要進行的reaction數量（可多估計1~3個reaction的量，以避免pipetting error），計算共需多少Supermix Buffer進行反應；(3)加入Reagent與樣本的順序（SupermixÆ滅菌過濾的ddH2OÆPrimer1ÆPrimer 2ÆProbe最後加!）(4)注意!!一個基因會有一個搭配的Probe與兩個搭配的Primers，所以請不要加錯管子，一般會一個基因準備一個Supermix的配方，所以也需要一個單獨的specific NTC（No Template ControlÆ用於觀察Probe是否水解）；(5)當Supermix與primers、probe混合好後，小心地將20 μl的Supermix混和液加入96 well plate或8連排的PCR專用試管當中（注意!請勿杯壁下流）；(6)最後加入 5 μl的cDNA template（若是NTC，則加入 5 μl滅菌過濾的ddH2O），並利用pipette進行mix，加入sample完畢後，將96 well plate利用3M刮刀將封膜密封，確認樣本盤之tube底部無氣泡（底部氣泡會影響螢光偵測準確性），即可放入機器中進行PCR反應；15.Real Time PCR機器與軟體操作方法(1)開機順序（光源ÆPCRÆPCÆ放入樣本盤）；(2)設定樣本盤的排列順序與PCR的溫度Progra m；(3)上機開始PCR反應，約1.5~2小時可以完成實驗；(4)詳細步驟，如下：選擇或編輯已有的Protocol1.在 Protocol 按鍵下，利用瀏覽視窗找到資料夾的位置。
实时荧光定量PCR仪操作流程
实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。
通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。
下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。
1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。
2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。
（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。
（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。
（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。
（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。
仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。
（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。
（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。
3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。
（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。
（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。
pcr操作步骤及注意事项
pcr操作步骤及注意事项嘿，咱今儿就来讲讲 PCR 操作步骤和那些得特别留意的事儿！PCR 啊，就像是一场微观世界里的奇妙旅程。
先来说说操作步骤吧。
第一步，就像准备一场盛大演出前的准备工作，得把各种试剂啊、样本啊都妥妥地备好。
然后呢，就是设计好反应体系，这可不能马虎，就跟搭积木一样，得把各个部分恰到好处地组合起来。
接下来，把这些东西都放进 PCR 仪这个“魔法盒子”里，设定好温度、时间这些关键参数，就像给这场旅程规划好路线。
然后呢，就等着PCR 仪发挥它的魔力啦！可别小瞧了这些步骤，每个环节都有不少讲究呢！比如说样本准备，这可得精心处理，要是样本出了岔子，那后面可就全白搭啦，这就好比盖房子根基没打好，那房子能稳吗？还有反应体系的设计，各种成分的比例得恰到好处，多一点少一点都可能影响结果，这就跟做菜似的，调料放得合适，菜才美味呀！再来说说注意事项，那也是一堆堆的呀！首先，实验室的环境得保持干净整洁，不能有任何杂质来捣乱，这就跟我们的家一样，干净整洁才能住得舒服嘛。
操作的时候，一定要小心谨慎，千万别把不该碰的碰了，不该洒的洒了，那可就麻烦大了。
而且啊，试剂的保存也特别重要，该冷藏的冷藏，该避光的避光，就像对待宝贝一样呵护着它们。
还有，使用仪器设备也要规范，不能随便乱搞，不然仪器“发脾气”了，咱可就不好办啦！PCR 操作就像是一场精细的舞蹈，每个动作都要恰到好处。
咱得时刻保持警惕，注意每一个细节，不能有丝毫的马虎。
想象一下，如果因为一点点小疏忽导致结果不准确，那多让人郁闷呀！所以呀，一定要认真对待，把每个环节都做到位。
总之呢，PCR 操作可没那么简单，但只要咱用心去做，注意好每一个步骤和事项，就一定能在这个微观世界里舞出精彩，得到准确可靠的结果！咱可不能小瞧了这些小小的实验操作，它们可是有着大大的学问呢！大家加油吧！。
qPCR实验操作流程
1)细胞培养皿中细胞样品用1＊PBS 洗两次后,用1ml 枪将PBS 吸干净，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1。
5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀, 室温放置5min 使其充分裂解；(管盖与管壁都需标记样品名称) 2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3—5min ； (离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)3) 4℃下，14，000g 离心15min ，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的RNase free EP 管；(用20—200ul 的枪吸取上清，吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层) 4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀 (颠倒6—8 次) (不应用振荡器混匀),室温静置10min；5) 4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA 沉淀(如离心后仍不见EP 管底部有沉淀，应将EP 管放置在-80 度冰箱过夜,继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA 沉淀),去上清；6) 用75％乙醇洗涤两次(12,000g 离心5min ) (加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀) ,超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
7) 视沉淀量加入适量 DEPC 水(至少 15ul )溶解沉淀.使用 RNase —free 的 DNase І(Promega ) ,按以下体系配置反应液， 37℃消化 30min ，65℃灭活 10min 。
RNA 30 µl DNase І20 µl 10 x buffer10 µl H2O (RNase free) 39.5 µl RNasin 0.5 µl 总体积100µl然后按以下步骤操作：1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀， 室温放置 5min,后 14，000rpm, 离心 15min,取上清。
PCR技术的操作注意事项
PCR技术的操作注意事项PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于分子生物学和遗传学研究中。
在进行PCR实验时，为了获得准确可靠的结果，有一些操作注意事项需要被遵守。
1. 实验室准备在进行PCR实验之前，实验室应该保持整洁干净，并进行彻底的清洁，以避免样品的污染。
实验室人员应佩戴实验手套，避免DNA的污染。
2. 基础操作规范2.1 温度控制PCR反应需要精确的温度控制。
在进行热循环时，各个步骤的温度和时间必须严格按照实验方案来操作，以确保PCR反应的准确性和重复性。
2.2 冷藏样品PCR实验中的样品应保存在冷藏条件下，以避免其降解。
在实验过程中，如果需要长时间悬挂样品，应将其放入冰上保持低温。
2.3 制备试剂所有使用的试剂和缓冲液都应经过适当的制备和保存，以保持其活性和稳定性。
试剂的浓度和pH值应经常检查。
2.4 避免污染PCR实验中最大的威胁之一就是样品的污染。
为了避免外源性DNA的污染，需要使用精确的pipetting技术和无DNA的试剂。
同时，实验室工作区域应与样品预处理区域和扩增反应区域分开，分别使用不同的工作台、试剂和实验器材。
3. 试剂的选择PCR反应中，应该选择高质量的试剂，如聚合酶、引物和dNTP等。
试剂的质量对PCR反应结果有重要的影响，应选择具有稳定性和高效性的试剂。
4. 引物的设计PCR反应的成功与否很大程度上依赖于引物的选择和设计。
引物的设计应遵循一定的原则，如引物长度应在18至30个碱基对之间，GC含量应在40%至60%之间，引物之间的Tm值相似等。
5. 负对照和阳性对照在进行PCR实验时，应设计负对照和阳性对照以验证试验过程的可靠性。
负对照是在反应中不加入DNA样品，仅使用水取代。
阳性对照是以已知的模板DNA的PCR产物作为试验的对照。
6. 结果分析PCR反应后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行分析。
在结果解读时，需要仔细观察和分析产物的大小和带状模式，以确定PCR实验的结果。
PCR-DNA荧光定量实验步骤及注意事项
Slan+YMDD试剂操作PCR-DNA实验注意事项1．加样方面（混匀，不要有气泡，管壁上不要有液体）2．试剂方面（冷冻，不宜反复冻融超过3次；可分装）3．使用非肝素钠抗凝剂采血管4．实验室方面（实验做完注意通风、84清理台面、紫外线杀菌）5．注意污染（平常配试剂管盖的放置不要污染、加样时指甲及手套不要碰到管内壁）实验操作步骤1.室温融解2.取血清（或标准品）50ul 加入50ul 核酸提取液先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心一下（等离心机转速到了接近6000按停止）99度水煮或干浴10分钟，稍微弹碎；然后13000转离心10分钟保留上清液备用3.配混合液取N*36ul 混合液+ N*0.4ul TAQ酶混匀（先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心）（N为管数，实际上我们要取N+1 因为加样管壁上会沾液不多配会导致最后一个有误差例如有10个样本则取11*36+11*0.4；）4.取上述混合液36.5ul分别加入pcr反应管不要有气泡管壁不要有水珠5.加样取4ul上清液加入pcr管加样枪在液体里面反复打个7~8下最后在离心机稍微离一下6000转瞬间离心6.上机反应检查管壁水珠气泡实验结果方面1.标准曲线相关系数至少为-0.99 越小越好2.根据曲线分析结果（曲线是否稳，无波浪）38循环曲线抬头为阴性实线抬头曲线不抬头为YMDD变异（实线---病毒量虚线---判断有无变异）21个循环值大概为7次方后面加3.5个循环减少一个次方即24.5左右为6次方......上述操作不一定全正确，请自行参考各试剂厂试剂说明书以及检验方面相关资料此文本仅为学习方便之途，为Vrirus实验当中自己理解，与各位互相分享学习Virus编辑于2013解释权归Virus所有联系:ooo788@。