提高D-酪氨酸生产效率的方法与相关技术

图片简介:

本技术介绍了一种提高D酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。本技术通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L酪氨酸转化为D酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。并通过优化全细胞转化条件，实现了D酪氨酸的高效生产。通过本技术生产的D酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。

技术要求

1.一种生产D-酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱

氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌，

所述D-氨基酸脱氢酶选自谷氨酸棒状杆菌，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

5.一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一

所述的重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生系统。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化条件是：pH 7～9，转化温度为15～37℃，转化时间20～24h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的重组菌的湿细胞进行转化。

9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～

1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～0.6mmol/L。

10.权利要求1-4任一所述的重组菌在食品、制药或化工领域的应用。

技术说明书

一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

技术领域

本技术涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。

目前，D-酪氨酸的合成方法主要包括化学拆分法、生物拆分法和酶转化法。化学拆分法面临拆分试剂贵、反应条件苛刻、产物收率低的问题。生物拆分法是利用普通变性杆菌细胞为生物催化剂，选择性降解D/L-酪氨酸中的L-酪氨酸来制备D-酪氨酸，但收率也极低。而酶转化法反应条件温和、立体选择性高、效率高，且方便快捷易操作，具有广阔的工业化开发前景。但目前有关酶转化法生产D-酪氨酸的报道较少，有文献利用奇异变形杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶、嗜热共生细菌来源的D-氨基酸脱氢酶转化L-酪氨酸来生产D-酪氨酸，并利用稳定伯克霍尔德菌来源的甲酸脱氢酶来实现辅酶NADPH的再生。但该级联系统对L-酪氨酸的转化率较低，只有45.3％。

技术内容

本技术的第一个目的在于提供一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

在本技术的一种实施方式中，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在本技术的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本技术的一种实施方式中，所述D-氨基酸脱氢酶(D-AADH)选自文献中报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述D-氨基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本技术的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(GDH)选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本技术的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本技术第二个目的在于提供了一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，所述方法为利用上

在本技术的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH的辅酶再生系统。

在本技术的一种实施方式中，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～

0.6mmol/L，所述重组菌经培养后以菌液的形式添加，转化温度为15～37℃，转化pH为7～9，转化的时间为20～24h。

在本技术的一种实施方式中，所述菌液的制备方式为离心收集菌体后溶于pH为7.0～9.0的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，菌体的添加量为10～30g/L。

本技术的第三个目的在于提供上述重组菌在食品、制药或化工中的应用。

本技术的有益效果：

(1)本技术所提供的利用重组菌转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的L-酪氨酸，三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，依据本技术可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。

(2)本技术所述的生产方法在将中间产物转化为D-酪氨酸的过程中利用辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中能循环再生，转化能够高效进行。

(3)本方法具有专一性强、底物成本低、产物光学纯度高等优点，采用本方法制备D-酪氨酸，添加L-酪氨酸50mmol/L，D-酪氨酸产量为8.4g/L，转化率达93％以上，转化周期需24h。

附图说明

图1：转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理图。

图2：不同缓冲液种类对转化率的影响。

图3：不同缓冲液pH对转化率的影响。

具体实施方式

种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L。

发酵培养基：胰蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4g，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容至1L。

样品制备：取1mL转化后的溶液，离心机12000rpm离心10min，取上清液经一定倍数稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液用来液相色谱分析。

D-酪氨酸含量的测定：安捷伦高效液相色谱仪，采用色谱柱:Daicel CrownpakCR-I(+) (150×3mm，5μm；Daicel Co.，Japan)色谱柱，流动相为pH 1.5HClO4：乙腈＝4：1，流速0.4mL/min，紫外检测器，检测波长210nm，柱温25℃。

L-氨基酸脱氨酶的酶活定义及测定方法：L-氨基酸脱氨酶的酶活是在50mmol/LL-酪氨酸，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过HPLC测定L-酪氨酸的减少量。酶活单位U定义为1min内L-酪氨酸减少1μmol所需的酶量。

D-氨基酸脱氢酶的酶活定义及测定方法：D-氨基酸脱氢酶的酶活是在50mmol/L对羟基苯丙酮酸，500mmol/L氯化铵，0.5mmol/L NADPH，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲

液，pH8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的减少量。酶活单位U定义为1min内NADPH减少1μmol所需的酶量。

葡萄糖脱氢酶的酶活定义及测定方法：葡萄糖脱氢酶的酶活是在200mmol/L D-葡萄

糖，0.5mmol/L NADP+，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的增加量。酶活单位U定义为1min内NADPH 增加1μmol所需的酶量。

转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理见图1。

实施例1：重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD的构建

人工合成的经过密码子优化的含有SacI和SalI酶切位点的PmLAAD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，用限制性内切酶SacI和SalI将PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-137℃酶切

2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有卡纳霉素的LB平板中培养

12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD。

实施例2：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH的构建

人工合成的经过密码子优化的含有EcoRI和SalI酶切位点的CgDAPDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，用限制性内切酶EcoRI和SalI将CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 37℃酶切2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养

基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH。

实施例3：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH的构建

以巨大芽孢杆菌的基因组为模板，以5，gaagatctcatgtataaagatttagaagg3，为正向引物，以5，ccgctcgagttatccgcgtcctgcttg3，为反向引物(划线部分分别为BglⅡ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得BmGDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，用限制性内切酶BglⅡ和XhoI将BmGDH基因和实施例2构得的质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 37℃酶切2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的BmGDH基因和质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH。

实施例4：双质粒重组大肠杆菌的构建和表达

将实施例1构得的质粒pRSFDuet-1-PmLAAD和实施例3构得的质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH经化学转化法同时转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素和氯霉素两种抗性的LB平板中培养12h，将平板中长出的单菌落，接种于含有卡那霉素和氯霉素抗性的种子培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以2％(v/v)的接种量转接到

100mL含有卡那霉素和氯霉素抗性的发酵培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃、200rpm下诱导12h后收集菌体用于全细胞转化。将全细胞超声波碎，测定酶活，结果显示，L-氨基酸脱氨酶的酶活为0.423U/mg 蛋白；D-氨基酸脱氢酶的酶活为0.028U/mg蛋白；葡萄糖脱氢酶的酶活为1.203U/mg蛋白。

实施例5：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化条件的优化

取实施例4中获得的湿菌体，离心收集菌体后作为催化剂进行全细胞转化。在L-酪氨酸浓度为50mmol/L，氯化铵浓度为500mmol/L，葡萄糖浓度为300mmol/L，NADP+浓度为

0.5mmol/L时，分别在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液或Na2CO3-NaHCO3缓冲液条件下25℃转化24h，结果如图2所示，当缓冲液为Na2CO3-NaHCO3时，转化率为87％，产量为7.9g/L。

在L-酪氨酸浓度为50mmol/L，氯化铵浓度为500mmol/L，葡萄糖浓度为

300mmol/L，NADP+浓度为0.5mmol/L时，分别在不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)的Na2CO3-NaHCO3缓冲液条件下25℃转化24h，结果如图3所示，Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH为7.5～9.0时，转化率为76～93％，产量达6.9～8.4g/L；Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH为8.0时，转化率为93％，产量为8.4g/L。

在NADP+浓度为0.5mmol/L时，加入不同浓度的L-酪氨酸(50mmol/L、100mmol/L、

150mmol/L)，6倍L-酪氨酸摩尔浓度的葡萄糖，10倍L-酪氨酸摩尔浓度的氯化铵，25℃转化24h，结果如图4所示，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L时，转化率为50～93％，产量达8.4～16.9g/L；当L-酪氨酸浓度为50mmol/L时，转化率为93％，产量为8.4g/L。

虽然本技术已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本技术，任何熟悉此技术的人，在不脱离本技术的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本技术的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60 ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatctaga 120 gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180 ggtgccggta ttcaggggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240 actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300 attagttacc aaacatcacc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360 cgtggcatga atgagaaaat tggtgcagat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420 gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480 gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540 cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720 gtgagtgaga aaggggcgat taaaacttct caagttgtac tcgccggggg tatctggtca 780 cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatctcaa 840 caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900 catttccgcg agcaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960 atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020 ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080 tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140 acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200 tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260 atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320 accgaaggcc cagcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380 attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga tgacgtagac 180 gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gatatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240 cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300 gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgtcgcac ttgtctccac cggctgggat 360 ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420 cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480 ggcgttcaaa aggccgtcca gtacaccctc ccatccgaag aagccctgga aaaggcccgc 540 cgtggcgaag ccggcgacct aaccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600 gccgatgccg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc cgactacttc 660 gttggctatg aagtcgaagt gaactttatt gatgaagcaa ccttcgacgc cgagcacacc 720 ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780 gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcctccgc gcagattgcc 840 tttggccgtg cagctcatcg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc 900 gaagttgcac catacctgct ctccccagaa aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960 taa 963

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌

atgtataaag atttagaagg aaaagtagtt gtcatcacag gttcatctac cggtttagga 60 aaagcaatgg cgattcgttt tgcaacagaa aaagccaaag tagttgtgaa ttatcgttct 120 aaagaagacg aagctaacag cgttttagaa gaaattaaaa aagttggcgg agaagctatt 180 gccgttaaag gtgacgtaac agttgagtct gacgtaatca atttagttca atctgcaatt 240 aaagaatttg gaaagttaga cgttatgatt aacaacgcag gactagaaaa tccggtttca 300 tctcatgaaa tgtctttaag cgattggaat aaagtaattg atacgaactt aacgggagct 360 ttcttaggca gccgtgaagc gattaaatat tttgttgaaa atgatattaa gggaacagtt 420 attaacatgt cgagtgttca cgagaaaatt ccttggccat tatttgttca ttatgcagca 480 agtaaaggcg gtatgaagct catgactgaa acactggcat tagaatacgc tccaaaaggt 540 attcgtgtaa ataacattgg accgggagcg attaatacac cgattaacgc tgagaaattt 600 gctgatcctg agcagcgtgc agatgtagaa agcatgattc caatgggata catcggagag 660 ccggaagaaa ttgcagcggt tgctgcatgg ctagcttctt cagaggcgag ttatgtaaca 720 gggattacgc tctttgctga cggcggtatg acacagtacc catcattcca agcaggacgc 780 gggtaa 786

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

1 5 10 15

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly 20 25 30

Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln 35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile 50 55 60

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val 65 70 75 80

Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala 85 90 95

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu 100 105 110

His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly 115 120 125

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp 130 135 140

Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu 145 150 155 160

165 170 175

Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala 180 185 190

Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro 195 200 205

Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn 210 215 220

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val 225 230 235 240

Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly 245 250 255

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro 260 265 270

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser Gly Val Pro Gly 275 280 285

Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu 290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser 305 310 315 320

325 330 335

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Ile Gly Glu Asp Leu Phe 340 345 350

Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro 355 360 365

Phe Glu Gln Phe Arg Val Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Gln His Leu 370 375 380

Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Thr Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys 385 390 395 400

Ser Glu Val Val Glu Arg Trp Gly Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp 405 410 415

Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile 420 425 430

Asn Thr Ala Thr Val Trp Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu 435 440 445

Val Thr Ala Asp Ile Val Met Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr 450 455 460

Pro Phe Ser Leu Asp Arg Phe Lys Lys

465 470

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15

Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30

Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45

Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60

Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80

Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95

Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110

Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140

Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly His Ser Gly Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160

Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Ile Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175

Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190

His Lys Met Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205

Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220

Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr 225 230 235 240

Gly Met Pro Asn Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255

Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270

Phe Thr Ala Ser Ala Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met

Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300

Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320

<210> 6

<211> 261

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌

<400> 6

Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser 1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala 20 25 30

Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val 35 40 45

Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly 50 55 60

Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile 65 70 75 80

85 90 95

Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val 100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser 130 135 140

Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp 195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile 210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagatctca tgtataaaga tttagaagg 29 <210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgctcgagt tatccgcgtc ctgcttg 27