提高D-酪氨酸生产效率的方法与相关技术
2023届陕西省高三第一次模拟考试理科综生物试卷(含解析)
2023届陕西省高三第一次模拟考试理科综生物试卷学校:___________姓名：___________班级：___________一、单选题1．茶叶生产在中国已有3000多年的历史，其中信阳毛尖以“细、圆、光、直、多白毫、香高、味浓、汤色绿”的独特风格，盛名传播国内外。
下列关于茶叶的说法，错误的是（）A．采摘的新鲜茶叶的细胞中含量最高的化合物是H2OB．茶叶和人体所含元素种类大致相同，但含量有差异C．制好的成品茶相比新鲜茶叶结合水/自由水的比值低D．新鲜茶叶的细胞内含量最多的有机物化合物是蛋白质2．甜菜素是一种水溶性含氮色素，因最早发现于甜菜根中而得名，酪氨酸酶是甜菜素合成的关键酶，下列图示为有关酪氨酸酶活性的实验研究结果，相关分析正确的是（）A．pH在4.5时，酪氨酸活性很低，后随着pH升高酶的活性先上升后下降B．B组实验时应在最适温度和最适pH条件下进行C．由B组实验可知，Cu2+提高酪氨酸酶活性的最适浓度为0.01mmol/LD．甜菜素可在细胞液中积累，其在细胞液中的积累不利于植物细胞的吸水3．金鱼能在严重缺氧的环境中生存若干天，其肌细胞和其他组织细胞中无氧呼吸的产物不同。
如图表示金鱼在缺氧状态下，细胞中的部分代谢途径。
下列相关叙述错误的是（）A．过程①不需要O2的参与，产生的物质X是丙酮酸，其由3种元素组成B．过程①有能量释放，释放的能量大部分用于合成ATPC．过程②④无氧呼吸产物不同，但在细胞内反应的场所相同D．在肌细胞中将乳酸经③②途径转化成酒精并排出体外，有利于防止酸中毒4．控制小鼠毛色的灰色基因既可以突变成黄色基因，也可以突变成黑色基因，而且基因突变的方向和环境没有明确的因果关系。
这说明了基因突变具有（）A．不定向性B．普遍性C．低频性D．随机性5．2021 年末，新发现的新冠病毒变异毒株奥密克戎比原始毒株的传染力更高，可通过咽拭子检测新冠病毒的感染者，下列叙述正确的是（）A．只有细胞内的核酸才是携带遗传信息的遗传物质B．与原始毒株相比，变异毒株的 RNA 由一条链变为两条链C．咽拭子检测新冠病毒利用了核酸分子具有特异性的原理D．在唾液中能检测到新冠病毒，说明该病毒能在细胞外繁殖6．下列有关生物学实验的描述正确的是（）A．斐林试剂和双缩脲试剂都为NaOH和CuSO4，但浓度和使用方法均无相同之处B．在“土壤中小动物类群丰富度的研究”中，采集的小动物可放入70%的酒精中，也可以放入试管中C．在“性状分离比的模拟”实验中，将抓取的彩球记录并放回原桶后即可进行下一次抓取，如此重复50~100次D．在“探索生长素类似物促进插条生根的最适浓度”实验中，可利用沾蘸法把插条基部在浓度较低的药液中蘸一下（约5s）后扦插，最好在遮阴、湿度高的环境中处理二、综合题7．粮食问题始终是全人类所面临的基本问题。
提高发酵产率与速度的方法
适当的渗透压可以促进微生物的生长和产物合成，过高或过低的渗透压会对微生物的生长产生不利影 响。
02
CATALOGUE
优化发酵工艺条件
控制温度和压力
温度
温度是影响发酵过程的重要因素，过高或过低的温度都可能对菌种的生长和代谢产生不利影响。通过控制发酵温 度，可以优化菌种生长和产物生成。
压力
在某些发酵过程中，压力也会影响菌种的生长和代谢。适当的压力可以改善溶氧水平，提高发酵效率。
调整pH值
02
03
调整溶氧浓度
通过实时监测发酵液的pH值， 及时调整pH值，以维持最佳的 发酵环境。
根据细胞生长和产物形成的需要 ，实时调整发酵液中的溶氧浓度 ，以提高发酵效率。
优化发酵过程模型与控制策略
建立数学模型
通过实验数据建立数学模型，描述发酵过程 中细胞生长和产物形成的变化规律。
优化控制策略
04
CATALOGUE
添加前体物质和酶抑制剂
前体物质添加
前体物质是微生物代谢过程中所需的 生长因子或合成产物的起始物质，添 加前体物质可以提高发酵产率。
例如，在抗生素发酵中添加前体物质 ，可以促进抗生素的合成，提高发酵 产率。
酶抑制剂添加
酶抑制剂可以抑制微生物中某些酶的 活性，从而影响微生物的代谢途径和 产物合成。
根据数学模型和实验结果，优化发酵过程的 控制策略，提高发酵产率与速度。
THANKS
感谢观看
基因工程育种
要点一
基因克隆与表达
将目的基因克隆到表达载体中，使其在菌体内高效表达， 提高发酵产率。
要点二
基因敲除与沉默
通过基因敲除或沉默的方法，消除菌体内某些不良基因的 表达，提高发酵性能。
酪氨酸酶作用机理
酪氨酸酶作用机理
酪氨酸酶是一种重要的酶，在乳制品加工、医药、化妆品等领域
中具有广泛的应用。
其作用机理是指酪氨酸酶能够将牛奶中的酪蛋白
分解为较小的肽链和游离氨基酸，从而改变牛奶的物化特性。
下面将
分步骤阐述酪氨酸酶的作用机理。
第一步：定位酪氨酸酶的活性中心
酪氨酸酶的分子结构中包含一个活性中心，通常是一组氨基酸残基，能够催化酪蛋白的降解。
这个活性中心的位置和构成对酪氨酸酶
的催化活性和与其底物的亲和力有重要的影响。
第二步：结合底物
酪氨酸酶的活性中心能够与酪蛋白中的特定结构域结合，从而使
酪蛋白在水中分解为多肽和游离氨基酸。
酪氨酸酶催化的反应在酪蛋
白中产生裂解，释放出破碎的多肽和氨基酸。
第三步：酶催化作用
酪氨酸酶催化的反应分为两步：
第一步是水分子攻击酪蛋白中的肽键，断裂肽链，形成一个临时
的酰-酶过渡态。
第二步是氨基酸残基与酰-酶过渡态相互作用，并在酶的作用下
被氧化，释放氨。
第四步：酶与底物的解离
酶基本上是一种催化剂，可以加速特定化学反应的速率，但化学
反应后酶并不会消失。
在酪氨酸酶催化下，酪蛋白分解为多肽和游离
氨基酸，酶依然存在于反应体系中，并可以继续催化其他反应。
在酶
催化作用完成后，酶与底物解离，以便继续催化下一个反应。
综上所述，酪氨酸酶作用机理可以通过四个步骤来解释，即定位
酶的活性中心、结合底物、酶催化作用和酶与底物的解离。
这一过程
可以加速降低牛奶中的酪蛋白分子，从而改变牛奶的化学和物理性质，具有非常重要的工业和农业应用价值。
酪氨酸生产工艺
酪氨酸生产工艺酪氨酸（Tyrosine）是人体所需的一种重要氨基酸，广泛应用于医药、保健品和食品等领域。
目前，酪氨酸的生产工艺主要包括化学合成法和微生物发酵法。
本文将重点介绍酪氨酸的微生物发酵法生产工艺。
酪氨酸的微生物发酵法主要采用大肠杆菌（Escherichia coli）或酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）作为发酵微生物。
下面将以大肠杆菌为例，介绍酪氨酸的生产工艺。
首先，对大肠杆菌进行预处理。
预处理主要包括培养基的配制、菌种的激活、菌液的接种等步骤。
培养基中包含了碳源、氮源、无机盐和微量元素等，为菌体提供生长所需的营养物质。
激活菌种是将冷冻保存的菌种接种到新鲜培养基中，使其重新恢复生长活力。
接种时，要保证菌种的纯度和活菌数，以提高发酵效果。
接下来，进行扩大菌种培养。
通过连续扩大培养来提高菌体密度和活性，以提高酪氨酸的产量。
扩大菌种培养一般需要具备合适的温度、pH和培养时间等条件，使菌体能够快速增殖。
然后，进行主发酵。
将扩大培养的菌种接种到发酵罐中进行主发酵。
主发酵过程中，需控制发酵条件，如温度、pH、通气速率和搅拌速度等。
此外，还要监测发酵液中酪氨酸的积累情况，以便及时采取措施调整和优化发酵过程。
最后，进行酪氨酸的提纯和纯化。
通过离心、过滤、浓缩和色谱等技术手段，将发酵液中的酪氨酸从其他杂质中分离出来。
提纯后的酪氨酸可以作为药品原料或者添加到食品和保健品中使用。
酪氨酸的微生物发酵法相对于化学合成法来说，具有操作简单、产量高、原料可再生等优势。
同时，微生物发酵法还可以通过调节培养条件和菌株筛选等手段，来提高酪氨酸的产量和纯度。
因此，目前微生物发酵法成为主流的酪氨酸生产工艺。
总之，酪氨酸的微生物发酵法生产工艺包括预处理、扩大菌种培养、主发酵和提纯纯化等步骤。
通过合理控制发酵条件和优化操作流程，可以实现高效、高纯度的酪氨酸生产。
未来，随着生物技术的不断发展和改进，酪氨酸的生产工艺将进一步精细化和优化，以满足人们不断增长的需求。
D—对羟基苯甘氨酸的合成方法及各自的优点
－，对羟基苯甘氨酸的合成1.1.对甲氧基苯甲醛法以上方法，合成收率为64.3％，拆分收率为73％，总收率约为47％。
该方法是早期用于工业生产D，L-HPG的合成方法，对甲氧基苯甲醛于氰化钠在水溶液或者醇溶液里面，经过环合，加压碱水解和脱甲基，得到D，L-HPG。
该工艺的优点是技术成熟，缺点是使用剧毒危险品氰化钠，生产和管理不便；在碱性条件下缩合时酚羟基容易氧化着色，杂质分离困难，生成的对羟基苯海因质量不好。
过去国内采用先醚化保护羟基，随后再水解的方式，虽然减轻了酚羟基氧化，但生产工艺复杂，生产成本高，已经被放弃了。
1.2.乙醛酸法1.2.1.对羟基扁桃酸氨解法乙醛酸与苯酚反应生成对羟基α－羟基苯乙酸，再在酸性或碱性情况下于50~70摄氏度反应，接缩合成D，L-对羟基苯海因，再经水解成DL-对羟基苯甘氨酸，收率为68%，反应条件易于控制。
但是反应时间长，收率偏低。
如果在第二步反应中加入相转移催化剂十八烷基二甲基苄基氯化铵，用苯二甲酰亚胺和氨水代替铵盐与对羟基扁桃酸反应，反应时间为8h,温度60℃，收率83.5%以上，产物纯度99%以上。
1.2.2乙醛酸水溶液、苯酚和醋酸铵“－步法”勒通收等人在前人研究的基础上，以乙醛酸水溶液、苯酚和醋酸铵为原料，采用－步法合成路线，合成了DL-对羟基苯甘氨酸。
原料摩尔配比：乙醛酸：苯酚：醋酸铵为1：1：4，体系的pH值为6.0～6.5、反应温度为30～35℃和反应进行24 小时的条件下，产率可达53.9％，纯度为98.5％。
与国外报道的相比，原料苯酚少用了－半，反应时间由48h缩短到24h，产率却超过了文献值。
殷树梅等又在乙醛酸、苯酚与铵盐作用，－步法合成目标产物的基础上进行改进，成功地以氨基磺酸代替醋酸铵，选用适当地催化剂，反应时间缩短为12h，产品收率达61％。
并确定最佳工艺条件为：原料摩尔比（乙醛酸：苯酚：氨基磺酸＝1.0：1.3：1.3），反应时间为12h。
万方数据杯检索大赛
B、2015
C、2017
D、2002
6、地方志中吴兴志乡里卷三的作者是a
A、宋·谈钥撰
B、宋·罗浚等纂修
C、明·卢熊撰
D、宋·范成大撰
7、到2017年为止，江南大学图书馆工作人员共发表期刊论文数量最接近的是（）。
A、800多篇
B、100多篇
C、1000多篇
D、550多篇
8、到2017年为止，江南大学申请的专利总量达到（）。
1、AP1000主要系统关键设计技术研究属于国家科技支撑计划
正确错误
2、表观遗传过程中的蛋白质修饰和调控研究于2016年批准立项
正确错误
3、论文《蛋白质酪氨酸磷酸酶家族不可逆苯并咪唑噻唑衍生物抑制剂的发现》的作者硕士阶段就读于山东大学的生命科学学院。
正确错误
4、《酶法生产壳寡糖及其质量控制研究》是江南大学食品学科白云鹏的硕士学位论文。
A、学术评价的多变量指标探讨
B、引文的本质及其学术评价功能辨析
C、图书馆学术文记录中的“文献出处”字段是指：（）
A、论文的作者
B、论文作者的工作单位
C、刊载论文的期刊名称及年卷期、起止页码
D、收录论文的书籍库
14、请用万方智搜学术资源发现服务平台检索，期刊《图书情报工作》的出版频次是（）
10、在万方知识服务平台检索“题名=量子力学”2010年的中文文献检索结果是
A、876
B、765
C、637
D、698
11、外文学位论文收录时间始于
A、1983年
B、1993年
C、1998年
D、1982年
12、请用万方智搜学术资源发现服务平台检索《中国图书馆学报》一刊于2017年刊登的主题为“学术评价”的论文题名为？
氨基酸类药物的生产方法
2、 目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法 有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成 法等四种。
3、 氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主 要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐 等化学方法或酶转化法生产。
（2）碱水解法 蛋白质原料经6mol／L氢氧化钠或 4mol／L氢氧化钡于100℃水解6h即得多种氨基酸混 合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但 含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用。 工业上多不采用。
（3）酶水解法 蛋白质原料在一定pH和温度条件下经 蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水 解法。
L-Leu自水及乙醇中得白色片状结晶，pI为5.98， 熔点为293℃，在25℃水中溶解度为2.19，乙醇中为 0.017;在75℃水中为3.82，在醋酸中为10.9，不溶于乙 醚。
（2）工艺路线：
（3）工艺过程：
①水解、赶酸 取6mol／L HC1 500L于1吨水解罐中， 投入100kg动物血粉，110～120℃回流水解24h后，于 70～80℃减压浓缩至糊状。加50L水稀释后，再浓缩 至糊状，如此赶酸三次，冷却至室温滤除残渣。
组氨酸可与HgC12形成不溶性汞盐沉淀，后者经 处理后又可获得游离组氨酸；
精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸 沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。
（3）吸附法 是利用吸附剂对不同氨基酸吸附力的差 异进行分离的方法。如颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨 酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸 附力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来。
氨基酸的生产方法
氨基酸的生产方法目前世界上氨基酸的生产技术主要有四种方法：发酵法、化学合成法、化学合成 - 酶法和蛋白质水解提取法。
（1）发酵法发酵法生产氨基酸是利用微生物具有的能够合成其自身所需的各种氨基酸能力，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种缺陷型及抗性的变异菌株，以解除代谢节中的反馈与阻遏，达到以过量合成某种氨基酸为目的的一种氨基酸生产方法。
应用发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸，基次是赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。
另外，色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸等也可由发酵法获得，但因生产水平低，尚不具备实用价值。
生产菌株一般是各种营养缺陷型的黄色短杆菌。
微生物细胞内氨基酸的生物合成都是利用能量代谢过程中衍生的一些中间代谢产物为起点，经过一系列伴随着自由能损失的不可逆反应，来保证各种氨基酸的不断供应。
（2）化学合成法化学合成法借助于有机合成及化学工程相结合的技术生产氨基酸的一种方法。
虽然化学合成法可以生产目前已知的所有氨基酸，但多数不具备工业价值，原因是应用化学生产的氨基酸含有 D 和 L 两种旋光异构体（手性异构体），其中的 D- 异构体不能被大多数动物所利用。
因此，用化学合成法生产氨基酸时除考虑合成工艺条件外，还要考虑异构体属性问题和 D- 异构体的消旋利用，三者缺一都影响氨基酸的利用。
在氨基酸工业中应用化学合成法批量生产的氨基酸仅限于甘氨酸、蛋氨酸和色氨酸。
其中，甘氨酸是应用化学合成法生产的最理想的品种，因为甘氨酸没有旋光异构体。
DL 混合型蛋氨酸及色氨酸能为畜禽利用，因此也具有一定价值。
（3）化学合成 - 酶法此法生产氨基酸的原理是利用化学合成法制得的廉价中间体，借助酶的生物崔化作用，使许多本来用发酵法或化学合成法生产的光学活性（具有不同旋光异构体）氨基酸具有工业生产的可能。
应用此法批量生产的氨基酸有赖氨酸、 L- 胱氨酸。
（4）蛋白质水解法蛋白质水解法生产氨基酸是传统的氨基酸生产方法。
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图片简介:本技术介绍了一种提高D酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。
本技术通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L酪氨酸转化为D酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。
并通过优化全细胞转化条件，实现了D酪氨酸的高效生产。
通过本技术生产的D酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。
技术要求1.一种生产D-酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌，所述D-氨基酸脱氢酶选自谷氨酸棒状杆菌，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
5.一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一所述的重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化条件是：pH 7～9，转化温度为15～37℃，转化时间20～24h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的重组菌的湿细胞进行转化。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～0.6mmol/L。
10.权利要求1-4任一所述的重组菌在食品、制药或化工领域的应用。
技术说明书一种提高D-酪氨酸生产效率的方法技术领域本技术涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。
以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。
目前，D-酪氨酸的合成方法主要包括化学拆分法、生物拆分法和酶转化法。
化学拆分法面临拆分试剂贵、反应条件苛刻、产物收率低的问题。
生物拆分法是利用普通变性杆菌细胞为生物催化剂，选择性降解D/L-酪氨酸中的L-酪氨酸来制备D-酪氨酸，但收率也极低。
而酶转化法反应条件温和、立体选择性高、效率高，且方便快捷易操作，具有广阔的工业化开发前景。
但目前有关酶转化法生产D-酪氨酸的报道较少，有文献利用奇异变形杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶、嗜热共生细菌来源的D-氨基酸脱氢酶转化L-酪氨酸来生产D-酪氨酸，并利用稳定伯克霍尔德菌来源的甲酸脱氢酶来实现辅酶NADPH的再生。
但该级联系统对L-酪氨酸的转化率较低，只有45.3％。
技术内容本技术的第一个目的在于提供一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
在本技术的一种实施方式中，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。
在本技术的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本技术的一种实施方式中，所述D-氨基酸脱氢酶(D-AADH)选自文献中报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述D-氨基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本技术的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(GDH)选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本技术的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
本技术第二个目的在于提供了一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，所述方法为利用上述重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生体系。
在本技术的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH的辅酶再生系统。
在本技术的一种实施方式中，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～0.6mmol/L，所述重组菌经培养后以菌液的形式添加，转化温度为15～37℃，转化pH为7～9，转化的时间为20～24h。
在本技术的一种实施方式中，所述菌液的制备方式为离心收集菌体后溶于pH为7.0～9.0的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，菌体的添加量为10～30g/L。
本技术的第三个目的在于提供上述重组菌在食品、制药或化工中的应用。
本技术的有益效果：(1)本技术所提供的利用重组菌转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的L-酪氨酸，三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，依据本技术可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。
(2)本技术所述的生产方法在将中间产物转化为D-酪氨酸的过程中利用辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中能循环再生，转化能够高效进行。
(3)本方法具有专一性强、底物成本低、产物光学纯度高等优点，采用本方法制备D-酪氨酸，添加L-酪氨酸50mmol/L，D-酪氨酸产量为8.4g/L，转化率达93％以上，转化周期需24h。
附图说明图1：转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理图。
图2：不同缓冲液种类对转化率的影响。
图3：不同缓冲液pH对转化率的影响。
图4：底物浓度对转化率的影响。
具体实施方式种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L。
发酵培养基：胰蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4g，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容至1L。
样品制备：取1mL转化后的溶液，离心机12000rpm离心10min，取上清液经一定倍数稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液用来液相色谱分析。
D-酪氨酸含量的测定：安捷伦高效液相色谱仪，采用色谱柱:Daicel CrownpakCR-I(+) (150×3mm，5μm；Daicel Co.，Japan)色谱柱，流动相为pH 1.5HClO4：乙腈＝4：1，流速0.4mL/min，紫外检测器，检测波长210nm，柱温25℃。
L-氨基酸脱氨酶的酶活定义及测定方法：L-氨基酸脱氨酶的酶活是在50mmol/LL-酪氨酸，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过HPLC测定L-酪氨酸的减少量。
酶活单位U定义为1min内L-酪氨酸减少1μmol所需的酶量。
D-氨基酸脱氢酶的酶活定义及测定方法：D-氨基酸脱氢酶的酶活是在50mmol/L对羟基苯丙酮酸，500mmol/L氯化铵，0.5mmol/L NADPH，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的减少量。
酶活单位U定义为1min内NADPH减少1μmol所需的酶量。
葡萄糖脱氢酶的酶活定义及测定方法：葡萄糖脱氢酶的酶活是在200mmol/L D-葡萄糖，0.5mmol/L NADP+，200mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的增加量。
酶活单位U定义为1min内NADPH 增加1μmol所需的酶量。
转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理见图1。
实施例1：重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD的构建人工合成的经过密码子优化的含有SacI和SalI酶切位点的PmLAAD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，用限制性内切酶SacI和SalI将PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-137℃酶切2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。
挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。
经测序验证，构建得重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD。
实施例2：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH的构建人工合成的经过密码子优化的含有EcoRI和SalI酶切位点的CgDAPDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，用限制性内切酶EcoRI和SalI将CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 37℃酶切2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。
挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。
经测序验证，构建得重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH。
实施例3：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH的构建以巨大芽孢杆菌的基因组为模板，以5，gaagatctcatgtataaagatttagaagg3，为正向引物，以5，ccgctcgagttatccgcgtcctgcttg3，为反向引物(划线部分分别为BglⅡ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得BmGDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，用限制性内切酶BglⅡ和XhoI将BmGDH基因和实施例2构得的质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 37℃酶切2h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的BmGDH基因和质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。