色谱分析(中国药科大学) 第3章 气相色谱分析
色谱分析（中国药科大学）第3章气相色谱分析
第三章气相色谱分析
第一节气相色谱仪的流程
气相色谱仪是一种多组分样品的分离分析工具，它采用气体为流动相。其简化的工作流程见下图。载气由高压钢瓶或氮气发生器供给，经减压阀、流量表控制计量后，以稳定的压力、恒定的流速，连续流过气化室、色谱柱、检测器，最后放空。样品进样后在气化室高温气化，被栽气带入色谱柱进行分离，被分离后的样品组分再被栽气带入检测器进行检测，最后检测信号由工作站采集并记录。
1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净
化干燥管；4-针形阀；5-流量
计;6-压力表；4-针形阀；5-流
量计;6-压力表；9-热导检测
器；10-放大器；11-温度控制
器；12-记录仪。
填充柱气路：
毛细管柱气路：气色检工
载
进（以FID为
毛细管柱气相色谱系统与填充柱气相色谱系统的气路显著不同，毛细管柱的载样量小，所需载气流速也小0.2~5ml/min ，使用常规微量注射器进样时，柱子必然超负荷，得不到毛细管柱的高效分离能力。因此常用间接进样法，即分流进样法。分流进样法进入柱子的样品量只是进样量的极小部分，因此不会超载。此外，毛细管柱气路在柱后有补气（make-up gas ，又称尾吹气），即从柱尾向检测器吹气，使柱中的组分一出来便被送到检测器，补气的目的是防止峰展宽。
色谱柱是色谱仪的“心脏”，样品中各组分的分离是在色谱柱中完成的。气相色谱法中所采用的柱子分二类：一类为填充柱，另一类为毛细管柱。
图3-1 填充柱
气检
工
载
进（以FID 为分
补
图3-2 毛细管柱
填充柱：内径2—6mm，柱长0.5—6m，柱内填充一定粒度的填料，填料的粒度一般有三种规格，即60—80目，80—100目、或100—120目。目为粒度单位，指一英吋长度上可排列的颗粒的数目。
在填充柱色谱中，填料如用固体吸附剂则为气固填充柱色谱（GSC），如用涂了固定液的担体，则为气液填充柱色谱（GLC）。
毛细管柱（又称Golay 柱或空心柱），内径0.1—0.5mm，柱长10—100m，中空，内壁涂布或键合有固定液。
色填充
分
制备柱：内径
气—固
气—液
内径2~6mm，柱
长0.5~6m，填料毛细管柱：内径0.1~0.5mm，固定液
第二节填充柱
一．固定液
固定液是GLC的固定相，一般是高沸点有机物，有许多商品化的固定液可供用户选择，以适应不同样品的分析要求，柱中固定液的用量也可以根据不同的情况进行选择，因此，固定液具有广泛的适用性。
（一）对固定液的要求：
1．热稳定性好，化学稳定性好，在柱温下不热解，不应与样品组分、担体、柱材料及载气发生不可逆反应。
2．蒸气压低，在操作温度下一般应低于0.1mmHg，否则固定液易流失，影响柱使用寿命、保留时间及检测器。
3．对样品组分有一定的溶解度，否则样品组分不被保留而得不到分离。
4．对样品组分具有选择性，不同的组分有不同的分配系数，以利分离。
5．对担体有湿润性，以利于在担体表面形成均匀液膜，以增加柱效。
（二）固定液的使用温度
固定液有最高使用温度及最低使用温度。
最高——由固定液的热稳定性及蒸气压决定。
最低——由固定液的熔点或软化点及粘度决定。
（三）样品组分与固定液之间的分子作用力
组分分配系数的大小是GC中的关键问题，这取决于样品组分与固定液之间的相互作用力。有关GC分离的相互作用力有四种：
1．定向力
由极性分子的永久偶极间的静电作用形成的。如极性组分与强极性固定液PEG-20M等的作用力。
2．诱导力
在极性分子的永久偶极的电场作用下，邻近的可极化的非极性分子可产生诱导偶极，因而两分子间产生相互作用力，这种作用力通常较小。
3．色散力
非极性分子由于原子核和电子的运动，产生瞬间偶极，因而产生相互作用，这种力普遍存在，但非极性分子间的作用力仅此一种。此作用力更弱。
4．特殊作用力
主要来源于组分与固定液形成络合物。例如含有Ag+的固定液与烯烃可形成络合物。
（四）固定液及其选择
选择固定液一般以“相似相容”为原则，即组分的结构、性质与固定液相似时，在固定相中的溶解度大，因而保留时间长；反之，溶解度小，保留时间短。如烃类化合物最好用烃类固定液（角鲨烷、阿皮松L ）。而极性化合物用极性固定液，如醇类可选用聚乙二醇为固定液。为此，固定液常以相对极性分类。
1．Rohrs Chneider 常数（罗氏常数）P
Rohrs Chneider （罗氏）提出了一种固定相极性的分类法：以角鲨烷的极性为零，β，β＇—氧二丙腈的极性为100，其它固定液的极性按下式计算：
式中，q 为丁二烯和正丁烷在固定液上的相对保留值之比的对数，即：
q 1、q 2、q x 分别为待测物在氧二丙腈、角鲨烷及欲测固定液上的q 值。按这一方法测出的相对极性，从0至100分为五级，每20为一级，用“＋”表示。
固定液的相对极性 q
1 q
1
q = log ×
t R' 丁t R'
固定液相对极
级
+ + + + + +
相对极0~20 20~40 40~60
按上述方法不能反映出样品组分与固定液之间的全部相互作用力，只是反映了色散力和诱导力。
2．McReynolds常数（麦氏常数）
Mc Reynolds改进了罗氏的方法，采用下列十种化合物作为检测物：
1．苯 2.丁醇 3.戊酮[2] 4.硝基丙烷 5.吡啶 6. 2－甲基－戊醇
7. 1－碘丁烷8.辛炔[2] 9. 1，4－二氧六环10.顺－四氢化茚
麦氏常数△I的计算公式如下：
△I = Ip —Ia
式中，Ip为某组分在待测固定液上的保留指数，Ia为同一组分在角鲨烷上的保留指数，一种固定液在规定的十种组分上测得的各个△I值，体现了组分与固定液间的色散力、诱导力、定向力与氢键力。因而比较全面地反映了该固定液的分离特性。
由△I值可得出如下结论：当固定液品种不同，但△I值均几乎相同时，它们的分离特性也几乎相同，如SE-30，OV-1，OV-101，DC-410，SE-96。当固定液之间的△I值接近时，它们的分离特性也接近，如DC710与OV-17。当固定液间的△I值差别大时，它们的分离特性也有很大差别。
3．固定液的种类
（1）按极性分类
非极性固定液如：角鲨烷0
弱极性固定液如：SE-30，OV-1，OV-17 +或++
中极性固定液如：QF-1，OV-225 +++
强极性固定液如：聚乙二醇类，聚酯类++++或+++++
（2）按使用温度分类
低温固定液50℃以下如：β，β＇—氧二丙腈
中温固定液50~200℃如：角鲨烷（125℃）
PEG 6000（200℃）高温固定液200~300℃如：PEG-20M（250℃）
（3）按化学结构分类
烃类如阿皮松L（混合烃），角鲨烷
甲基硅酮类如SE-30，OV-17等
聚乙二醇类如Carbowax 20M（即PEG-20M）等
聚酯类如DEGA，DEGS等
在实际工作中选择固定液时，除了应用“极性”这一概念外，还应仔细分析各组分的化学结构，充分利用组分与固定液分子间的各种相互作用力。以下对药物分析中常用的几种固定液简介如下：
甲基硅酮（又称甲基聚硅氧烷）：各种硅酮类是目前最广泛使用的固定液，其可使用的温度范围大，对一般的有机化合物有较好的溶解能力。这类固定液在高温下，强酸、强碱和氧气能使硅氧键断裂，所以最好使用中性担体并除去载气中的微量氧气。
①甲基硅酮：
CH
3Si
CH
3
CH
3
O Si
CH
3
CH
3
O
n
Si
CH
3
CH
3
CH
3
SE-30 最高使用温度300℃极性+ 溶剂：氯仿
OV-1 最高使用温度350℃极性+ 溶剂：氯仿
甲基硅酮SE-30，OV-1是最常用的固定液，极性很弱，与组分的相互作用力主要是色散力，对含氧化合物有一定的选择性。对于烃类等非极性化合物基本上按沸点顺序分离。
②苯基甲基硅酮：
CH
3Si
CH
3
CH
3
O Si
CH
3
O
n
Si
CH
3
CH
3
CH
3
OV-17 最高使用温度300℃极性++ 溶剂：氯仿
由于硅原子上引入苯基，与甲基硅酮相比较，芳香化合物的溶解度升高，极性组分的保
留值增大。按苯基含量的不同，有低苯基（含苯基25%），中苯基（含苯基50%）及高苯基硅酮之分。OV-17属中苯基硅酮。此类固定液适合于分离甾体化合物、生物碱、醇类、糖类等化合物。
③ 氰烷基硅酮：
CH 3Si CH 3
CH 3
O Si C 2H 4CN CH 3
O
n
Si CH 3CH 3
CH 3
CH 3
Si CH 3CH 3
O Si C 3H 6CN CH 3
O
n
Si
CH 3CH 3
CH 3
这类固定液含有电负性的氰基，对极性组分有较强的定向力，对易极化组分可使之产生诱导偶极。氰基中氮原子未用电子对，能与醇类、酸类等形成氢键。是极性较强、选择性高、热稳定性好的少数固定液之一。适用于分离糖类、醇类、酚类、甾体化合物、脂肪酸等。
④ 氟烷基硅酮：
CH 3Si
CH 3
CH 3
O
Si
CH 3CH 3
CH 3
Si C 2H 4CF 3CH 3
O
n
QF-1含三氟丙基，对硝基化合物和酮类有显著的选择性保留。而对芳烃和醇类则否。对于酮-芳烃，酮-醇能很好地分离。 ⑤ 聚乙二醇：
XE-60
+++
OV-225
QF-1
+++
HO
CH 2CH 2
O
n
H
PEG20M ++++ 250℃ 氯仿
PEG 6000 ++++ 200℃ 氯仿 PEG400 ++++ 125℃ 氯仿
这类固定液含有醚基及羟基，是氢键型固定液。在氢键的形成中，既是氢键的质子接受体又是质子给予体。它们能与羟基化合物、碱性含氮化合物、酮类等形成氢键。组分在这类固定液上的保留主要取决于氢键力的大小。适合于分离醇类、醛类、脂肪酸类、酚类、生物碱、酯类等化合物。
⑥ 聚酯：
CH 2CH 2CH 2O CH 2CH 2O C O
CH 2CH 2CH 2CH 2C O
O
n
DEGA ++++ 200℃ 氯仿
CH 2CH 2O CH 2CH 2O C O
CH 2CH 2C O
O
n
DEGS ++++ 200℃ 丙酮
DEGA 、DEGS 等为线性脂肪族聚酯，酯基中的氧原子有未用电子对，有亲核性，能与带部分正电荷的氢形成氢键。另外，由于诱导效应（酯基的），存在着α活泼氢原子，所以有亲电性，对烯烃、芳烃、杂环化合物有较大的作用力。适用于分离醇类、酚类、脂肪酸类、酯类、胺类等化合物。
4．固定液的选择
固定液的选择在很大程度上是经验过程。最好参考已发表的分离相同或相似结构化合物的文献。选择固定液时一般可遵循的原则是：
（1）“相似相容”
分离极性大的组分，则选用极性大的固定液。分离非极性的组分，则可选用非极性或弱极性固定液。无论采用非极性或极性固定液，一般沸点小的先出峰（对同系物而言）。
（2）若样品中的待测成分一个是极性组分，另一个是非极性组分，则采用极性固定液比非极性固定液有利。
（3）若样品中的待测组分容易形成氢键，则采用氢键型固定液（如PEG-20M ）较为有利。
（4）混合固定液
对于复杂混合物样品，如无适当的单一固定液时，则可考虑选择混合固定液。实践证明，混合固定液的保留值具有加和性。因此，在同一条件下分别测出被分离组分在单一固定液柱上的调整保留时间（t R ＇）后，可用图解法求出混合固定液的最佳配比。其具体操作如下：
设有1，2，3三个样品组分，在固定液A 上1，2分不开，在固定液B 上1，3分不开。以混合固定液的配比为横坐标，以t R ＇为纵坐标，将相同组分的t R ＇以直线相连。从上图可以看出在70%A+30%B ，以及25%A+75%B 时均能使1，2，3 三个组分得到最佳分离，他们三者的出峰顺序分别为1→3→2和1→2→3。组分在A ，B 两种混合固定液上的保留值具有如下关系：
若组分在纯A 固定液柱上的保留值为t R ＇A ，固定液重W A ；
t R
＇
3
1
0 25 50 75 100 B
A 100 75 50 25 0
1
2
30
75
3 2
1
2 3 1 B
若组分在纯B 固定液柱上的保留值为t R ＇B ，固定液重W B ； 在混合柱（含A 的重量为 W A ＇，B 的重量为W B ＇）上为t R ＇X 则：（混合固定液的保留值具有加和性）
制备混合固定液柱的方式：
二．担体
担体的作用是支持固定液，使成均匀薄膜，以利气液平衡。 （一）要求
颗粒均匀，比表面积大，机械强度好，热稳定性好，化学惰性等。 （二）常用担体
药物分析中常用担体为硅藻土担体。 1．分类
红色担体：天然硅藻土烧结而成，含氧化铁而成红色，结构紧密，机械强
度好，表面有氢键及酸碱活性作用点。主要用于非极性固定液（样品）。
白色担体：硅藻土+助熔剂（Na 2SO 4）煅烧而成，其中氧
化铁变成无色的铁硅酸钠配合物。结构疏松，机械强度较前者差，易碎而产生结粉，极性中心较红色担体少。
混合
混装
（一根
联合柱（二根色谱柱
t R ＇X
W A W A ×t R ＇A
W B
W B
×t R ＇B
2．担体的表面处理
酸洗：6mol/L HCl ，除去担体表面的铁等金属氧化物 ↓
水洗：使成中性 ↓
烘干 ↓ 硅烷化 硅烷化法：
方法一：试剂为 1~2% 二甲基二氯硅烷的甲苯溶液
Si O
Si
OH OH Si
CH 3
Cl
CH 3Si
O Si
O
Si
O
CH 3CH 3
+
或
Si O Si
OH Si CH 3Cl
CH 3
Si O Si
O Si CH 3
Cl
CH 33+
Si O
Si
O Si CH 3
O
CH 3CH 3
方法二：六甲基二硅胺的石油醚溶液
Si O
Si
OH OH Si CH 3
CH 3
CH 3
NH
Si CH 3
CH 3
CH 3
Si
O Si CH 3
CH 3
CH 3O
Si
O
Si CH 3CH 3CH 3+
目前多用硅烷化白色担体，如
102白色硅烷
Chromosorb
G
Chromosorb W 硅酸洗法
三. 色谱柱的制备
(一) 固定液的涂布
称取担体适量置圆底烧瓶中，再按比例称取固定液适量，用有机溶剂洗入圆底烧瓶中，加有机溶剂使担体淹没，将圆底烧瓶置水浴中加热回溜5~6小时，再置旋转蒸发仪上，缓缓减压浓缩至干，置60~100℃烘箱中静态老化12~24小时，以除去残余溶剂。
(二) 柱管预处理
填充柱的柱管材料有不锈钢管和玻璃管两种。
内径2mm~6mm，长1~6m，U形或螺旋形。
不锈钢柱：热5~10% NaOH液冲洗→水洗至中性→乙醇
→乙酸乙酯→有机溶剂洗→烘干。
使用前清洗
玻璃柱：洗液浸泡→水洗至中性→烘干。
（三）柱子填装及老化
1．装柱
加一匙料，在柱子的四周敲击一次，再加一匙料，再在柱子的四周敲击一次，直至填满，填满后在柱子的入口处填上玻璃棉。填口作为入口。
硅烷化
水泵
2．老化
装柱子入口处与气路相接，另一端放空（不能与检测器相连，以免老化时污染检测器），将柱温设置在低于固定液最高使用温度30℃处，加热老化24~48小时，以除去填料中残余溶
剂及固定液中带来的低分子聚合物。
四．填充柱操作条件的选择
（一）载气
GC中的载气有氮气、氦气、氩气、氢气。
FID检测器时：普氮。
ECD检测器时：高纯氮、氦气。
TCD检测器时：氢气及氦气均可达到较高灵敏度。
MSD检测器时：氦气。
（二）温度：
原则：
1．检测器温度至少比柱温高30℃。以防柱中流出物在检测器上凝结，污染检测器。
2．柱温至少比固定液的最高使用温度低30℃。以防固定液流失。
3．柱温降低，保留时间延长，k’↑，分离可得到改善。
4．气化室温度一般与检测器温度相同，若待测物不稳定，则气化室温度应设低一点。
第三节毛细管柱
在60年代至70年代毛细管柱（Capillary Column）气相色谱法取得了很大发展，它解决了许多复杂的分离分析问题。那时毛细管柱的柱壁材料为玻璃。但在使用过程中人们很快感受到了玻璃作为毛细管柱柱壁材料的二大缺点：
1、玻璃毛细管柱无柔性，容易碎裂，这是导致其被逐步淘汰的主要缺点。
2、玻璃表面具有一定的活性，包括金属氧化物及质子供体和受体作用。
1979年产生了熔融二氧化硅空心柱FSOT（Fused Silica Open Tubular），亦称“柔性石英毛细管”。FSOT化学惰性，强度好，有弹性，可绕成圈状，而其本来状态是直的，故便于安装、使用。FSOT开发出来以后，迅速被商品化，并得以迅速普及。以下将从用观点出发，对这种柱进行讨论。
一．柱管
送料器
炉
激光直径测
涂布
干燥
固化
毛细
卷绕
上图为毛细管拉制机的示意图。以合成二氧化硅为原料，炉温为2000℃，将熔融二氧化硅毛细管从炉内拉出，然后涂上外保护层。常用的保护涂层为聚酰亚胺。涂布保护层的目的是防潮及防止擦伤管壁。未加保护层的FSOT柱受湿度影响，易于断裂，这是因为水分子侵
袭Si-O 键形成硅醇基。
Si O
Si
O
Si
O
Si H2O Si O Si OH+Si
HO O
Si
虽然合成熔融二氧化硅含金属氧化物很低（〈1ppm〉，但是由于表面的硅醇基仍然存在，而呈现残留活性，因此需用硅烷化等方法去活性。
二．柱类型
（一）壁涂开管柱WCOT（Wall Coated Open Tubular）
WCOT柱是较常用的毛细管柱。可实验室制备，也可从市场购买。商品化的WCOT柱内径从0.05mm至0.53mm，内壁均匀涂布了固定相，如SE-30，OV-1，OV-225，PEG20M 等。固定液膜厚0.1μm~0.8μm。固定相是溶解在溶剂中，用静态法或动态法涂布的。
1．动态法
将要涂布的固定液配制在合适的低沸点溶剂中（如SE-30可用二氯甲烷），溶液浓度随固定液粘度而异，一般为10~60%（W/V），将配好的溶液压入柱子，使其在柱中形成液塞，液塞长度约为柱长的20%，在氮气压力下严格控制液塞的移动速度，当液塞离开柱子以后继续通氮气以吹干溶剂，使毛细管壁上留下一层固定液的液膜。
动态法方便、快速，但重现性不够理想，涂出的柱子柱效相对较低。
2．静态法
将事先配制好的低浓度固定液（0.5~2%，W/V）充满整个毛细管柱，柱子的一端经严格排除气泡后用封口胶封住，开口的一端连接到真空系统。在恒温下（低于溶剂沸点10~20℃）减压除去溶剂。
柱子涂布好固定液后，置柱室，通氮气（流量要小，不宜过大），并按一定的温度程序老化8~12小时。
（二）固定化固定相柱（immobilized solid phase open tubular）
为了得到稳定的固定相涂层，在涂布了固定液后，常常需要使之横向交联（cross-linked）或键合（bonded）使之稳定。横向交联是指通过反应处理，使固定相分子相互键合，形成更大、更稳定的大分子薄膜。键合是指经化学处理后，将固定相结合在毛细管内表面。固定相的横向交联是通过游离基起始剂而完成的。游离基起始剂包括氧化物、γ射线、臭氧和偶氮
化合物。
典型的横向交联反应为：
CH Si CH 3O
O CH 2
CH 3
Si CH 3O O CH 2Si CH 3O
O CH 2OR
Si O O
CH 2
CH 3
ROH
2RO·
横向交联及键合的优点：
（1）产生稳定的涂层，固定相流失大大减少。
（2）得到不可提取（non-extractable ）的涂层，在不分流进样时，固定相涂层不会被样品溶
剂溶解或剥落。如色谱柱污染，可用溶剂冲洗进行再生。洗涤溶剂：戊烷、甲醇。
（3）使用温度范围宽。比未交联的固定相可加热至更高的温度或冷却至更低的温度。但聚酰
亚胺涂层在380℃以上不稳定。
（三）其它毛细管柱
多孔层开管柱PLOT （Porous Layer Open Tubular ） 载体涂布开管柱SCOT （Support Coated Open Tubular ） 壁处理开管柱WTOT （Wall Treated Open Tubular ） (此部分不作要求，有兴趣可自学，无太多实用性) 三．色谱柱的选择
FSOT 柱的选择应考虑固定相，柱内径，固定相膜厚度及柱长等。 （一）固定相
可参照填充柱，但由于FSOT 柱有很高的柱效，固定相的选择不如填充柱那样重要。大多数工作可在SE-30及OV-101柱上完成。 （二）柱内径与固定液膜厚度
内径0.25mm ，膜厚0.25μm 的柱是常规柱，兼顾了柱效和样品容量。 1．为了增加载样量
可选择内径较大，液膜较厚的柱，如0.35mm i.d .×0.50μm 的柱，但增加载样量是在牺牲柱效的条件下获得的。
2．为了提高柱效
可选择细内径，薄涂层的柱，以分析复杂样品。如0.15mm i.d.×0.1μm 的柱。 3．固定液的流失比例与柱中固定液的重量
对于GC-MS 这种高灵敏度的检测器，宜选用细内径、薄涂层FSOT ，如0.2mm i.d.×0.1μm 柱。 （三）柱长
一般有12m ，25m ，50m 三种，所需柱长取决于样品的复杂性。复杂样品需长柱，短柱分析速度快。
（四）柱子的维护与贮存
1．载气纯度要高
如用高纯氮气（99.999%），载气纯度不高柱寿命下降，如Carbowax 易氧化。 2．柱老化
新柱要老化。老柱也要定期老化，以除去样品中的难挥发物在柱头的积累。否则基线
漂移，峰拖尾。
3．柱不用时将两端封闭，置于盒中。 4．柱污染时用戊烷、二氯甲烷或甲醇冲洗。 四．进样系统
毛细管柱GC 系统如下，其与填充柱GC 系统的气路显著不同。
分流的目的：防止毛细管柱超载。
补气的目的：从柱尾向检测器吹气，使柱中的组分一出来便被送到检测器，以防峰展
气检 记
载
进 分
补
宽。
（一） 分流进样
毛细管柱的载样量小，所需载气流速也小0.2~5ml/min ，使用常规微量注射器进样时，柱子必然超负荷，得不到毛细管柱的高效分离能力。因此常用间接进样法，即分流进样法。分流进样法进入柱子的样品量只是进样量的极小部分，因此不会超载。此外，分流进样法的另一重要作用是汽化室中载气流量大，速度快，被汽化了的样品在汽化室停留时间短，很快进入柱子，同时汽化室也能得到迅速的冲洗，这样避免了非瞬间进样而引起的谱带展宽。
1．分流比
分流比可以定义为：在所进样品完全气化，并与载气充分混合的条件下，样品通过分流进样器进入柱子的流量Fc ，与通过分流器放空的流量F 分流之比。
分流比 S= Fc / F 分流 可通过皂膜流量计测定 常用分流比为1：20~1：300。
由于载气通过毛细管柱的流量很小，用皂膜流量计不易测量，Fc 也可以通过计算求出：
Fc = пr 2
L/ t M
分流口
载气