实验一-3-5-二硝基水杨酸比色法-复原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。
本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。
一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。
2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。
3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。
将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。
在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。
(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。
(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。
(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。
(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。
(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。
(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。
二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。
然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。
在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。
还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。
三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法，其原理基于还原糖在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物，而总糖则在强硫酸存在下加热分解，生成由葡萄糖和六碳糖等组成的还原糖，在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物。
具体操作步骤如下：1. 取一定质量的山楂片粉末，加入适量的蒸馏水，加热水浴至沸腾，过滤，将过滤液冷却至室温。
2. 取0.2 ml 过滤液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
3. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，还原糖含量的计算公式为：还原糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
4. 取剩余过滤液，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，浸于沸水中煮2小时，浸于水中冷却，并用蒸馏水将瓶口水洗入容量瓶，摇匀。
5. 取0.1ml 还原糖水样稀释液加入容量瓶，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，摇匀后加入适量的蒸馏水到刻度线，摇匀后离心。
6. 取0.1 ml 离心上清液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
7. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，总糖含量的计算公式为：总糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
总之，3,5-二硝基水杨酸法是一种稳定可靠的方法，能够准确测定山楂片中的还原糖和总糖含量，为山楂片的质量控制提供了重要的参考。
总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制-3,5-二硝基水杨酸法
2、样品中总糖的水解、提取
准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状
取1～2滴于六凹 反应盘中，加1滴 I2-KI溶液，如果 完全不显蓝色，
即可进行下面的 操作。
再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl 沸水浴，30min (不时搅拌)
冷却至室温 用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸）
五、操作
1、样品中还原糖的提取
准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状 再加30ml蒸馏水
50℃水浴，30min (不时搅拌)
转移至50ml离心管中，4000rpm，5min
上清液1 沉淀
加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min
上清液2 沉淀(弃) 置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀， 取1ml即可进行还原糖的测定。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及 其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为 棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
NaOH 加热
黄色
棕红色
在过量的NaOH碱性溶液中， 3-氨基-5-硝 基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸 收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与 光吸收值成线性关系。利用比色法，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲 线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖 的含量。
实验一、总糖和还原糖的测定
——3,5-二硝基水杨酸法
一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理； 2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原
糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类， 单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还 原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样 品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来； 对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解 法使其降解成有还原性的单糖进行测定， 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量 （还原糖以葡萄糖含量计）。
实验一,3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
百度文库- 让每个人平等地提升自我实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
植物组织中总糖及还原糖的测定
3、样品含糖量的测定: 、样品含糖量的测定 取提取液1.0ml，按上表操作。 取提取液 ，按上表操作。
五、计算： 计算
还原糖含量(µg/ g )=
还原糖含量χ1(µg) ×样液总体积 测定用样品液体积×样品鲜重(g)
总糖含量(µg/ g )=
水解后还原糖含量 (µg) ×样液总体积×0.9 测定用样品液体积×样品鲜重(g)
四、实验步骤： 实验步骤：
1、葡萄糖标准曲线的绘制 、 2、还原糖的提取 、 3、样品含糖量的测定: 、样品含糖量的测定
1、葡萄糖标准曲线的绘制: 、葡萄糖标准曲线的绘制
支试管， 取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标， 支试管 按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标， 对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
三、实验材料、仪器和试剂： 实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：苹果（约0.5 g） 、实验材料：苹果（ ） 2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 3、试剂： 、试剂：
（1）1 mg/mL葡萄糖标准液 ） 葡萄糖标准液 二硝基水杨酸（ 碱性) （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 碱性 ） 二硝基水杨酸 ）试剂(碱性 （3）6M HCl和6M NaOH ） 和
管 号 0(参比溶液 参比溶液) 参比溶液 1 2 3 4 5
还原糖提取液
葡萄糖 蒸馏水 DNS 沸水 蒸馏水 光密度值 标准液 mL mL mL OD540nm 浴 mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.0 5min 冷却
4
葡萄糖含 量（µg） ） 0 200 400 600 800 1000
还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法
还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉；精密pH 试纸。
2. 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3. 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
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实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、实验目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器
（1）大试管：2×20cm×14
（2）烧杯：100mL×3
（3）三角瓶：100mL×1
（4）容量瓶：100mL×3
（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4
（6）吸耳球、玻璃棒
（7）恒温水浴锅
（8）漏斗、滤纸
（9）白瓷缸、电炉
（10）精度天平
（11）分光光度计
3．试剂（已制备）
（1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
（3）6mol/L HCl和6mol/L NaOH 。
四、操作步骤
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支2×20cm大试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水冷却至室温，用蒸馏水补充至20mL （即各加入16.5mL蒸馏水），震荡混匀，在分光光度计上进行比色。
调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的吸光度值。
以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
2．样品中还原糖和总糖的测定
（1）还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。
将浸出液用100mL容量瓶定容，混匀，过滤，滤液作为还原糖提取液，待测。
（2）总糖的水解和提取
准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min。
待三角瓶中的水解液冷却后，用6mol/L NaOH中和（大约10mL左右），用广范pH试纸测试中和到pH=7，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。
将定容后的水解液过滤，取滤液1 mL，移入另一9mL水的试管中，混匀，稀释10倍作为总糖待测液。
（3）显色和比色
取7支2×20cm大试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，用7号管进行空白调零。
加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
五、结果与计算：
利用8、9、10号管吸光度值和11、12、13管吸光度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，分别计算出还原糖和总糖的平均值，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
六、注意事项
1． 试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。
2． 试管要提前标号。
3． 移液管使用前要润洗。
4． 移液管要专管专用。
5． 分光光度计要预热30分钟。
6． 比色皿要用擦镜纸擦干，尤其是光滑面，更不能用手碰。
7． 保持环境干净，废液倒在废液缸中，废纸放入垃圾桶中。
8． 标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色，并使用同一参比溶液调零点和比色。
9． 用分光光度计比色时，应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，再用待测液润洗，之后再
装待测液。
七、思考题
1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2．比色测定时为什么要设计空白管？
八、预习题
1. 什么是还原性糖
2. 高中学过测定还原性糖的方法是什么？其原理和操作又是什么？
还原糖（%）= 查曲线所得还原糖毫克数×稀释倍数
×100
样品毫克数
总糖（%）= 查曲线所得总糖水解后毫克数×稀释倍数
×0.9×100
样品毫克数。