mRNA差异显示技术ppt课件
mrna差异表达
mrna差异表达摘要：1.mRNA 差异表达的概述2.mRNA 差异表达的原因3.mRNA 差异表达的应用4.mRNA 差异表达的挑战与未来发展正文：1.mRNA 差异表达的概述mRNA 差异表达是指在不同的生物体、不同组织、不同发育阶段以及不同处理条件下，基因的表达水平出现差异，从而导致mRNA 的表达量也不同。
这种现象在生物学研究中具有重要的意义，因为mRNA 差异表达往往与生物体的生长、发育、免疫、疾病等许多生物学过程密切相关。
2.mRNA 差异表达的原因mRNA 差异表达的原因多种多样，主要包括以下几个方面：(1) 基因本身的特性：不同的基因具有不同的表达水平和表达模式，这是由基因本身的序列特性、结构和功能决定的。
(2) 表观遗传调控：表观遗传是指通过化学修饰等方式，在不改变DNA 序列的前提下，影响基因的表达。
这种调控机制可以导致mRNA 的表达水平发生变化。
(3) 转录后调控：转录后调控是指在mRNA 合成后，通过剪接、修饰、运输和降解等过程，调控基因表达。
这些过程可以导致不同条件下mRNA 表达水平的差异。
(4) 环境因素：外部环境因素，如温度、光照、营养等，可以影响生物体内基因的表达，从而导致mRNA 差异表达。
3.mRNA 差异表达的应用mRNA 差异表达在生物学研究中具有广泛的应用价值，包括：(1) 基因功能研究：通过研究不同条件下基因表达水平的变化，可以推测基因在生物体内的功能和作用机制。
(2) 疾病诊断：许多疾病都与基因表达异常有关，通过检测mRNA 差异表达，可以为疾病的早期诊断和疗效监测提供依据。
(3) 药物研发：mRNA 差异表达可以为药物靶点发现和药物筛选提供重要线索。
4.mRNA 差异表达的挑战与未来发展尽管mRNA 差异表达研究取得了显著进展，但仍面临许多挑战，如数据分析方法的完善、样本多样性、数据标准化等。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的mRNA 差异表达数据得以积累，为数据挖掘和生物信息学分析提供了基础。
mRNA差异显示技术概述
抑 制有 关 的基 因鉴定 与克 隆 中 ，这种 方法 称 为差异
显 示 反转 录聚合 酶链 式反 应 （ Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｄ Ｒ —Ｃ 。
１ ｍＲ ＮＡ差 异显 示技术 的原 理
ｍ Ｎ 差异 显 示技 术 和 Ｒ Ａ 随机 引 物 聚合 酶 Ｒ Ａ Ｎ
链 式 反 应 （ Ａ — Ｃ 都 是 基 于 这 样 一 种 假设 ：只 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ）
中采用的只是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物， 而 ｍ Ｎ 差 异显 示 技 术 则是 根 据成 熟 的 ｍＲ Ａ ３ Ｒ Ａ Ｎ
端具 有 ８ ～ ０ ｐ的起保 护 作 用 的 ｐｌ（ 尾 巴这 ０ ２０ｂ ｏｙＡ）
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床 麻 醉 学 杂 志 ， ０ ０ １ （Ｏ ： ０ — ０ ． ２０ 。 ６ １ ） ５３ ５ ５
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人类 基 因组协 会公 布 的最新 数据表 明 ，人类 和 其他 高 等 生 物基 因组 可 能包 含 约 ３ ０ ００ ０蛋 白编 码 基 因 ，其 中 仅 约 １ ％被 认 为 是 在 不 同发 育 阶 段 、 ５
mRNA展示技术ppt课件
人们已利用这种新的技术鉴定了许多功能性 多肽，包括 RNA 结合肽、TNF-α 结合因 子等，建立了以 mRNA 体外展示技术筛选 与抗肿瘤药物的重要靶酶———胸苷酸合 成酶mRNA高度亲和多肽的方讨
Structure of mRNA-linker
体积25ul,其中含10xPCR缓冲液2.5 u凝胶载体上，然后加入 400ul
洗涤5~6遍后，加入洗脱液(无酵母 tRNA) 及
mRNA展示技 术
应用：
CAT(Cambridge Antibody Technology) 应用体外展示技术制备单克隆抗体用于疾 病的治疗：
D2E7 ABT-874 CAT-192and GC1008
CAT-5001 (formerly SS1P)
目前应用的组合多肽/蛋白质库技术包括 噬菌体展示技术(phage display) 酵母双杂交 与核糖体展示技术(ribosome display，RD) mRNA体外展示技术( mRNA display)
基本原理：借助一种蛋白质合成 抑制剂嘌呤霉素(puromycin)来 形成mRNA- 蛋白质融合体，从 而实现基因表型 (RNA)与蛋白质 表型(多肽) 的结合. 嘌呤霉素是 一种模拟子的3’端，当 mRNA 翻译完成时，嘌呤霉素进入核糖 体的 A 位点接纳新生肽，抑制蛋 白质翻译，在多肽与嘌呤霉素的 O- 甲基酪氨酸之间形成稳定的 酰胺键，生成肽酰嘌呤霉素复物， 而使mRNA3 ’端和蛋白质的羧基 端通过嘌呤霉素分子共价地联系 在一起。
DNA展示技术
mRNA体外展示又称mRNA- 蛋白质融合体 展示(mRNA-protein fusion display)，是 近年来发展的一种高效多肽选择技术。 它可以由大容量的多肽库中(1013 ~1015 个分子)获得具有特定生物学功能的多肽分子. 与噬菌体和核糖体展示技术相比，mRNA 体 外展示技术具有多肽库容量大、筛选方法简 便等优点，特别适用于获得小分子功能性多 肽
mRNA差异显示技术解读
八.DDRT-PCR的技术改进
针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面 做了大量改进：
引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定
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引物设计
mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增 效果最好
王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列， 提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜
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三、mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用 cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙 烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差 异。其中，反转录技术中使用了一系列能与 mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚 脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与 mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录 酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。
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mRNA差异显示技术简略流程图
六. DDRT-PCR的优点
以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的 差异 可以同时检测到“上调”及“下调” 的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析
主要用于医学研究的癌症、神经、 骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微 生物等领域
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五. DDRT-PCR一般操作步骤
总RNA的提取与反转录 RT-PCR
聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收
PCR在扩增及其产物的回收
测序和数据库比对分析
实时定量PCR
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mRNA差别显示技术
数据处理与分析方法的改进
要点一
总结词
要点二
详细描述
数据处理与分析方法的改进可以提高mRNA差别显示技术 的可重复性和可解释性。
采用先进的数据处理和分析方法，如归一化处理、差异表 达分析、生物信息学分析等，可以更准确地识别差异表达 的基因。归一化处理可以消除实验误差和批次效应，差异 表达分析可以筛选出显著变化的基因，生物信息学分析可 以对这些基因进行功能注释和通路分析。此外，建立标准 化和规范化的数据处理流程可以提高技术的可重复性和可 比性。
详细描述
差显PCR使用特定的引物对cDNA进行扩增，这些引物能够识别出在不同条件下表达的基因的差异。通过调整 PCR条件，如温度、循环次数和引物浓度，可以优化差显PCR的效果。扩增后的产物通过凝胶电泳进行分离，以 便后续的分析和测序。
序列测定与数据分析
总结词
对PCR产物进行测序，并利用数据分析找 出差异表达的基因。
疾病研究
mRNA差别显示技术在疾病研究方面具有重要价值，可以用于研究疾病发生、发展过 程中基因表达的变化，为疾病的诊断、治疗和预后评估提供依据。
药物研发
通过mRNA差别显示技术，可以发现与药物作用相关的基因，为新药研发提供候选靶 点，加速药物研发进程。
技术发展前景与展望
01
技术改进
随着测序技术的不断发展，mRNA差别显示技术有望得到进一步改进，
VS
详细描述
通过适当的测序技术，如Sanger测序或下 一代测序（NGS），对PCR产物进行序列 测定。获得序列数据后，利用生物信息学 工具和算法进行数据分析，以识别出在不 同条件下表达的差异基因。这一步骤对于 深入了解基因表达模式和生物过程至关重 要。
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mRNA差别显示技术的优化与 改进
(汇总)mRNA差别显示技术.ppt
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9、双向电泳技术
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等 电聚焦电泳和SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠—聚丙烯 酰胺凝胶电泳）的组合，即先进行等电聚焦电泳（按 照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大 小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自 的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.
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mRNA差别显示技术
DNA指 纹
Jeffreys等用肌红蛋白基因的一个内含子 的串联重复序列作探针，从人的基因文 库中筛选出8个含有串联重复序列的重组 克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复 单位的长度和序列不完全相同，但都有 相同的核心序列，他们先后用两个小卫 星探针进行Souther杂交，在低严谨条件 下杂交图谱的带型千差万刷，如人的指 纹一样．Jeffreys称之为DNA 指纹或遗传 指纹。
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8、噬菌体抗体库技术
以噬菌体(主要是丝状噬菌体、λ噬菌体和T4噬菌体)为 载体,将抗体基因插入噬菌体编码的外壳蛋白基因PⅢ或 PⅥ中,在噬菌体表面以抗体－外壳蛋白融合蛋白的形成 表达。经辅助病毒感染后,借助蛋白PⅢ的信号肽穿膜作 用,进入宿主外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾 部,随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片 段的噬菌体颗粒。此抗体可以特异性识别抗原,又能够 感染宿主菌进行再扩增,将B细胞全套可变区基因克隆 出来,组装成噬菌体抗体的群体,则成为噬菌体抗体库技 术。
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DNA指纹图
图为41个红花檵木品种嫩叶DNA，红花檵 木为我国特产的一种优良园林绿化观赏植物
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mrna差别显示技术分离产物
mrna差别显示技术分离产物
MRNA差别显示技术（Differential Display of mRNA，DD）是一种用于寻找不同表达的基因的方法，属于基因差异分析的一种。
该技术以聚合酶链式反应（PCR）为基础，利用反转录酶将mRNA逆转录成cDNA，利用DD引物引导PCR扩增特定区域的cDNA，通过PCR扩增产物的差异性，从而分离出不同表达的mRNA。
这个方法已被广泛应用于许多生物领域中。
DD技术的实验步骤如下：
（1）以反转录酶为媒介，将总RNA逆转录成cDNA，加上合适的引物，经特定PCR扩增后，在聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。
由于PCR扩增引物的选择性，只有与引物对应的mRNA 会被扩增出来。
（2）将不同条件下（如不同组织、不同发育阶段、不同细胞状态等）提取的RNA样品按照第一步的方法进行反转录、扩增和分离，得到不同的PCR产物。
（3）将不同条件下得到的PCR产物大小和数量进行比较，筛选出只在其中一个样品中存在的PCR产物，这就是mRNA的差异表达产物。
（4）将差异表达产物纯化后，进行后续的克隆、测序和同源比对等分析，确定其详细信息，为研究差异表达的基因提供线索。
DD技术的优点在于不需要事先了解基因的序列信息，能够从许多的基因中快速筛选出有差异表达的基因并进行深入研究。
缺点是有可能会测量到某些零星的基因表达变化，需要进行进一步的验证。
总之，DD技术在生物医学领域中具有广泛的应用前景，尤其在寻找某些疾病的分子机制和治疗靶点等方面起到了重要作용。
mRNA差异显示技术
mRNA差异显示技术mRNA differetial display1.概述mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。
•方法建立：1992年Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因•目前已应用于个各领域：–农业、植物–动物–医学•胚胎发育•遗传病•药物•肿瘤2.mRNA差异显示原理•是分离差异表达基因的一个重要方法。
人类大约含有三万个不同的基因。
在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。
•生物体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。
•生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。
•差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。
3.基本程序–选择表型特性差异显著对象–展示mRNA的差异–基因差异–克隆与表型差异高度相关的新基因4.技术•基本技术–逆转录（RT ）–聚合酶链反应（PCR）–凝胶电泳5.RT-PCR•锚定引物T12-MN，含有12个T可以结合于mRNA 3`端poly（A）尾，M为A、C、G 3种碱基之一，N为A、T、C、G 4种碱基之一。
•荧光锚定引物，引物5`端加入T7 RNA多聚酶启动子并带有荧光分子----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNAMTTTTTTTTTTTT（12T）Prime---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNANMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime•荧光锚定引物：NMTTTTTTTTTTTT-T7 RNA多聚酶启动子-荧光分子（Genomyx company）因此共有12种锚定引物•同位素标记锚定引物•随机引物（Arbitrary Prime）可以随机地与cDNA不同位置多个位点结合，扩增出不同长度的cDNA片段混合物。
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Poly(A) RNA 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ T12MN(M为A、G、C 5’ T12MN 3’ 逆转录 ，N为A、T、G、C) 锚定引物 启动cDNA M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’第一链合成 5 ’ 3 ‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 变性 3 ’ ‘ 5 M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3 ’ 5‘ T12MN 3’锚定引物 退火 寡核苷酸随机引物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ 随机结合到 cDNA链上
3‘
3‘ 5’
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 不同长度的 dNTP、Taq聚合酶 延长 PCR产物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增 ，克隆测序，同源比对
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四.DDRT-PCR目前的应用领域
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mRNA差异显示技术简略流程图
六. DDRT-PCR的优点
以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的 差异 可以同时检测到“上调”及“下调” 的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析
高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的体细 胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有 10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发 育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心 机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下， 或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些 特异性表达的基因。研究基因差异表达的主要技术有 差别杂交 (differential hybridization) 扣除（消减）杂交(Subtractive hybridization) mRNA差异显示技术 (mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR) 抑制消减杂交法 (suppressial substractive hybridization ,SSH) 代表性差异分析 (Represential display analysis ,RDA) 交互扣除RNA差别显示技 术(RSDD) 以及基因表达系列分析和电子消减
mRNA差异显示技术
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主要内容
一、概述：mRNA差异显示技术
二、DDRT-PCR的发明及其基础
三、mRNA差异显示技术的原理：
四、DDRT-PCR目前的应用领域 五、DDRT-PCR一般操作步骤 六、DDRT-PCR的优点及缺点 七、DDRT-PCR的技术改进
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一.概述：mRNA差异显示技术
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八.DDRT-PCR的技术改进
针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面 做了大量改进：
引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定
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引物设计
mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增 效果最好
王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列， 提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜
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1、mRNA 差别显示 技术：
mRNA差异显示PCR技术是1992 年由美国波斯顿Dena-Faber 癌症 研究所的Liang Peng 博士和Arthur Pardee 博士建立起来的一种用于 鉴定和克隆哺乳动物正常生理状态 和异常状态细胞之间差异表达基因 的方法,是目前筛选差异表达基因 最有效的方法,同时，研究mRNA 差异相对于研究DNA差异而言。 它排出了非编码区（内含子）的影 响，从而使得研究结果更加接近于 真实。
Байду номын сангаасPage 11
七.DDRT-PCR的缺点
假阳性高
样品mRNA可能有部分降解 有少量的DNA污染 单条带可能由一种以上cDNA 片段所构成 有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号 PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号
绝大多数差异条带仅含有3’-UTR 500bp以内的一短片段的 信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 对低丰度mRNA检出率低
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三、mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用 cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙 烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差 异。其中，反转录技术中使用了一系列能与 mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚 脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与 mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录 酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。
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二.
DDRT-PCR的发明及其基础
是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改 进，使技术更适用、更简便
由Liang于1992年创立
基于RT-PCR理论，依赖于3种技术
1）RT-PCR技术
2）以特定引物进行的PCR技术
3）DNA电泳技术
Liang还发现，当长度为13bp，在5’端增加 HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特 异性
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反应条件优化
RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带 不同条件下dNTP浓度不是固定不变的 1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好 40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效 果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严 谨的退火温度36℃，在随后的循环中退火温 度提高到45℃，获得了很清晰的电泳图谱
主要用于医学研究的癌症、神经、 骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微 生物等领域
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五. DDRT-PCR一般操作步骤
总RNA的提取与反转录 RT-PCR
聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收
PCR在扩增及其产物的回收
测序和数据库比对分析
实时定量PCR