20150423-酵母双杂--吴晓萌

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酵母双杂交-孔德晶

酵母转化(一)原理：我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。

LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态，此时它们能够摄取外源性DNA。

PEG是一种高分子聚合物，只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。

本文使用的PEG分子量为3350，实验结果表明转化效果可以达到103～105cfu/μg。

PEG在酵母转化中起到在高浓度LiAc环境中保护细胞膜，减少LiAc对细胞膜结构的过渡损伤，同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。

PEG的浓度是务必适宜，这一点很重要。

鲑鱼精DNA为短的线形单链DNA，在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解。

另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。

在每次使用前务必进行热变性，使可能结合的双链DNA打开，保证鲑鱼精DNA在转化实验体系中以单链形式存在。

(二)材料、仪器设备及试剂：1.SD 培养基：●YNB：1.6g/L●硫酸铵：5g/L●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加●调节pH=5.8，121°灭菌20min。

2.YPDA培养基●胰蛋白胨：20g/L●酵母浸膏：10g/L●琼脂：20g/L(固体)●腺嘌呤：15ml 0.2%腺嘌呤/L●调节pH =7.5，121°灭菌20min。

3.100%DMSO4.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）●Tris-HCl：1.211g/100ml●EDTA：0.37g/100ml●调节pH=7.5，121°灭菌20min。

5.10×LiAc（pH=7.5）●1M LiAc：10.202g/100ml●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min。

6.1×TE/1×LiAc现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlH2O 8mlTE 1×1ml 10×TELiAc 1×1ml 10×LiAc7.50% PEG3350：●PEG3350：50g●已灭菌的超纯水定容到100m。

酵母双杂交一对一验证

南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因
组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级
实验水平，
瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。

目前已经成熟的产品线如下:酵母核/膜文库的构建筛选体系、TF-centered Y1H技术研发、酵母外源基因分泌表达体系、酵母高通量逆境筛选技术等，以
及自主研发了切实有效的快速生物试剂盒，有酵母菌落PCR试剂盒、启动子文
库试剂盒、酵母工作菌液试剂盒等。

酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白

ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．ＧｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｓｓａｙｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｗｏｇｅｎｅｓ，ｗｅｃｈａｎｄＰｓｆｉ，ｍａｙｄｅｌａｙｔｈｅｄｉｓａｐ —
ｍｏｓｏｍｅｓｄｕｒｉｎｇｍｅｉｏｔｉｃｐｒｏｐｈａｓｅＩ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｇｅｒｍｃｅｌｌ — ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎＣ（２）Ｍｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｔｃｈｒｏｍｏ — ｓｏｍｅｓｃａｎｉｎｄｕｃｅＳＣｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣ（２）Ｍｉｎｍｅｉｏｓｉｓ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｂａｉｔｖｅｃｔｏｒｆｏｒＣ（２）Ｍａｎｄｕｓｅｄｔｈｅｙｅａｓｔｔｗｏ — ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＣ（２）Ｍｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ．
而成的超级复合结构。生殖细胞特异性的核蛋白Ｃ（２）Ｍ（Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｎ２ｏｆＭａｎｈｅｉｍ）在染色体上高度聚集可以诱导ｓｃ的形成。本文采用酵母双杂交方法，利用Ｃ（２）Ｍ的诱饵２）Ｍ相互作用的蛋白，包括多种ＤＮＡ及组蛋白结合蛋白、ＡＴＰａｓｅ、转录调节因子。从筛选的结果中，选取ｗｅｃｈ和基因构建了转基因果蝇，并在生殖细胞中进行了基因沉默，结果显示联会复合体的消失受

微波结合酶法破酵母细胞壁[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102071150 A(43)申请公布日 2011.05.25C N 102071150 A*CN102071150A*(21)申请号 200910154634.1(22)申请日 2009.11.23C12N 1/16(2006.01)C12N 1/18(2006.01)C12N 1/06(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(71)申请人湖州来色生物基因工程有限公司地址313100 浙江省德清县武康镇长虹街333号(72)发明人吴菁史利斌(54)发明名称微波结合酶法破酵母细胞壁(57)摘要本发明提供了一种酵母细胞的破壁方法，其步骤包括：酵母菌接种到300ml 液体种子培养基中培养，然后培养基分5份扩大培养，取一份培养基加入复合酶调节pH 至5.0，温度控制45℃培养6h ，离心得到酵母沉淀，冷冻后用微波加热处理。

本发明酵母细胞破壁设备要求低、操作工艺简单、破壁率高，非常适用于工业化生产。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 2 页1.微波结合酶法破酵母细胞壁，其特征包括以下几个步骤：(1)酵母菌培养将斜面培养基上的酵母菌接种到装有300ml液体培养基的锥形瓶中，置于30℃、180r. min-1转速的恒温震荡培养箱中培养20h。

将培养液分成5份接种到新的无菌培养液中，置于30℃、180r.min-1转速的恒温震荡培养箱中培养30h。

(2)复合酶破壁取一份培养液加入1.8g蜗牛菌，用HCl调节PH至5.0，控制温度45℃，180r.min-1转速下破壁6h。

(3)微波加热破壁将培养液离心(3600n/min)10min，得到酵母沉淀，置于冷冻箱中冷冻20min。

将冻结的酵母沉淀放入频率2450MHZ、输出功率750W的微波炉中处理30S。

此时酵母由固体逐渐变成为液体。

2.如权利(1)所诉酵母菌的培养，其特征在于所用的培养基为液体种子培养基[3％葡萄糖+1％玉米浆+0.2无机营养盐(营养盐的加量按C＝8∶1或50ml/l)]。

小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

西北农业学报 2022,31(8):948-957A c t aA gr i c u l t u r a eB o r e a l i -o c c i d e n t a l i sS i n i c a 网络出版日期:2022-06-30 d o i :10.7606/j.i s s n .1004-1389.2022.08.002网络出版地址:h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /61.1220.S .20220628.1726.002.h t m l 小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定收稿日期:2021-12-06 修回日期:2022-01-07基金项目:陕西省农业协同创新与推广联盟重大科技项目(L M Z D 202104);西北农林科技大学实验技术研究与实验室管理创新项目(S Y 20210227)㊂第一作者:李立群,女,硕士,高级实验师,主要从事实验教学和生物技术育种研究㊂E -m a i l :l i l i qu n @n w s u a f .e d u .c n 李立群,王冰心,吕千,杨智全(西北农林科技大学农学院,陕西杨凌 712100)摘要以中国春小麦叶㊁茎㊁幼穗及花后3㊁6㊁9㊁12㊁15㊁20㊁25d 的籽粒为材料,利用G a t e w a y 技术构建中国春小麦c D N A 初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y 187酵母菌株构建出酵母双杂交文库㊂通过m a t -i n g 法筛选小麦粒质量基因Ta D A R 1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性㊂结果表明:初级文库容量为1.82ˑ107C F U /m L ㊁次级文库的容量为1.91ˑ107C F U /m L ,文库重组率均大于96%,插入片段平均长度在1000b p 以上㊂酵母双杂交文库转化效率为1.97ˑ105C F U /μg ,文库容量为2.04ˑ107C F U /m L ㊂构建诱饵载体p G B K T 7-T aD A R 1并转化Y 2H 酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N 端无自激活,C 端有自激活,以B D -T a D A R 1-N 为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为T a -D A R 1I P ,经回转验证T a D A R 1-N 与T a D A R 1I P 存在相互作用关系㊂表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的㊂为初学者构建酵母双杂文库及使用 m a t i n g 法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础㊂关键词小麦;酵母双杂交文库;自激活检测;文库筛选中图分类号 S 512.1 文献标志码 A 文章编号 1004-1389(2022)08-0948-09构建高质量的酵母双杂交文库是研究蛋白互作关系,筛选未知基因的基础[1-2],是揭示基因蛋白功能及解析其作用机理的前提㊂近年来,酵母双杂文库被广泛应用,在挖掘新基因及基因功能研究方面发挥了重要作用㊂农作物如水稻㊁棉花㊁青稞[3-5]及麦类作物[6-8]中普遍采用,水果[9-10]蔬菜[11-13]也屡见报导㊂杨少丽等[14]利用G a t e w a y技术构建菊芋块茎全长c D N A 文库,用于菊芋功能基因组研究㊁新基因筛选㊁高通量E S T 测序以及菊芋c D N A 芯片制备㊂叶夏林等[15]构建南通小方柿c D N A 文库,筛选D k G A 2o x 2基因上游转录因子,研究矮化基因调控机制㊂陈玉婷等[16]构建花生受青枯菌诱导的根部组织文库,筛选到抗青枯病A h R R S 5基因的互作蛋白A h S B T 1.6,并证明其参与调控花生青枯病抗性㊂可见,酵母双杂文库在蛋白互作及功能研究中发挥了不可替代的作用㊂小麦是中国主要的粮食作物,粒质量是重要的产量性状,粒质量基因研究国内外报道较多[17-19],小麦育种技术研究与新品种培育创新团队已经取得了一定成果[20-22]㊂然而,为了深入开展基因功能研究,揭示调控籽粒大小的分子机制,筛选粒质量基因作用的关键靶标蛋白,必须首先构建基因文库㊂目前在小麦中建立的c D N A 文库多基于S MA R T 技术,以小麦叶片为主要材料,集中在抗病基因的挖掘和研究[23-25]㊂近期王巧慧等[26]以小麦抗病材料叶片构建酵母双杂c D -N A 文库,筛选获得2个与热休克蛋白H S P 40-70互作的蛋白质,为抗逆研究奠定基础㊂但基于g a t e w a y 技术以中国春小麦各种组织为材料构建酵母双杂交文库尚未见报道㊂本研究中,以中国春小麦不同组织及不同花后时间的籽粒为材料,基于I n v i t r o ge n 的g a t e -w a y 技术,利用C l o n e M i n e r I I 试剂盒构建中国春小麦c D N A 初级文库,然后L R 重组构建出次级文库,再依据次级文库质粒构建出酵母双杂交文库,并以小麦粒质量基因T a D A R 1(G e n e I D :A K 457429.1)为例,构建诱饵表达载体P G B K T 7-Copyright ©博看网. All Rights Reserved.T a D A R1,然后用m a t i n g法进行文库筛选,并对文库质量及有效性进行鉴定㊂研究为初学者了解酵母双杂文库构建㊁酵母感受态细胞制备以及从文库中筛选基因的方法提供参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1试验材料中国春小麦品种,生物技术育种研究实验室繁殖保存㊂2019播种于西北农林科技大学北校区小麦育种试验田,在小麦孕穗期,分别取叶片㊁茎杆组织及幼穗,-80ħ保存,待小麦开花后再分别取3㊁6㊁9㊁12㊁15㊁20㊁25d的小麦籽粒,液氮速冻,-80ħ保存,备用㊂1.1.2主要试剂载体:p D O N R222㊁p G A D T7㊁p G B K T7;菌株:酵母Y2H㊁Y187㊁大肠杆菌等㊂I n v i t r o g e n公司试剂盒:C l o n e M i n e r I I c D N AL i-b r a r y C o n s t r u c t i o n K i t㊁T R I z o l R e a g e n t㊁F a s t-T r a c k MA G m R N A i s o l a t i o n K i t㊁S u p e r S c r i p t I I IF i r s t-S t r a n dS y n t h e s i sS y s t e mf o rR T-P C R㊁B P C l o n a s eʻR I Ie n z y m e m i x及L R C l o n a s eI I M i x等;酵母质粒提取试剂盒㊁O X O I D公司S O C Y N B㊁Y e a s te x t r a c t㊁北京天根公司胶回收试剂盒㊁质粒小提试剂盒㊁诺唯赞生物科技公司各种限制性内切酶㊁2X T a q M a s t e r M i x㊁C l o n E x p r e s s E n t r y O n e S t e p C l o n i n g K i t㊂本试验所用的引物由北京擎科生物科技公司西安分公司和生工生物(上海)技术有限公司合成,所有的测序工作由杨凌奥科生物科技有限公司承担㊂1.2方法1.2.1中国春小麦总R N A提取及m R N A分离取前期冻存的中国春小麦叶片㊁幼茎㊁幼穗,以及花后不同发育时期的籽粒,采取T r i z o l法提取各组织总R N A,用微量核酸分析仪n a n o-d r o p2000检测总R N A的质量和浓度,配制10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测R N A的完整性,然后根据R N A的量进行等比例混合建库㊂m R N A的分离纯化,具体参照O l i g o t e xm R-N A M i d iK i t说明书进行㊂取10μL进行电泳质检,观察电泳条带是否呈弥散状,以及高亮度所在区域㊂1.2.2中国春小麦c D N A文库的构建(1)中国春小麦初级文库的构建:将分离纯化好的m R-N A反转录合成双链c D N A,将c D N A分级分离和收集后用于B P重组反应㊂反应体系为20μL,包括13μL c D N A,2μL p D O N R222(200 n g/μL),5μLB PC l o n a s eʻR I I e n z y m em i x㊂反应产物经电转化大肠杆菌D H10B感受态细胞后,加入S O C培养基,置于37ħ㊁220r/m i n摇床培养1h㊂培养结束后,涂布平板用于库容量鉴定,剩余培养物加入甘油至终浓度20%,于-80ħ保存,即为中国春小麦c D N A初级文库菌液㊂(2)中国春小麦c D N A次级文库的构建:抽提中国春小麦c D N A初级文库质粒,稀释到300 n g/μL,利用L R重组反应构建中国春小麦c D N A 次级文库㊂反应体系为20μL,其中初级文库质粒(300n g/μL)1μL,p G A D T7-D E S T(300 n g/μL)1μL,L R C l o n a s e I IM i x4μL,d d H2O 14μL补足体积,将体系混匀后25ħ反应18~22 h㊂反应结束后将10μL重组产物和100μL电转感受态细胞冰上混匀,在1500V㊁200Ω㊁25μF 电击条件下,转化D H10B感受态细胞㊂将电转化产物移入新的离心管,培养后涂布平板用于库容量鉴定,剩余培养物加入甘油至终浓度20%,存于-80ħ,即为中国春小麦c D N A次级文库菌液㊂(3)中国春小麦c D N A文库质量鉴定:取转化后细菌原液10μL稀释1000倍后,从中取出50μL涂布L B平板(初级文库抗性为卡那霉素,次级文库抗性为氨苄青霉素),37ħ,过夜培养,第2天计数㊂每毫升大肠杆菌文库菌液库容量(C F U/m L)=平板上的克隆数/平板上涂布菌液的体积(μL)ˑnˑ1000(μL),n为稀释倍数㊂(4)重组率和插入片段长度的分析鉴定:重组率是菌落P C R中所有阳性插入片段的克隆在总检测克隆数中所占的比例;插入片段平均长度则是随机菌落P C R所鉴定得到的插入片段长度的总和的平均值,本试验需要通过文库质粒转化和克隆鉴定来获得㊂操作步骤如下:取200μL感受态宿主菌(D H5α),放置冰上融化,加入1μL文库质粒,轻轻混匀后置于冰上30m i n,42ħ水浴热休克90s,迅速放入冰上2m i n,加入300μL S O C培养基(不含抗生素),置于37ħ摇床,转速200r/m i n,复苏45m i n,菌液分别稀释1000倍㊁10000倍涂布于15c m培养皿上,37ħ过夜㊂然后,挑单克隆做菌落P C R,扩增反应所需引物见表1,扩增程序见表2㊂P C R产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,以此来计算初级和次级文库重组率及插入片段长度㊂㊃949㊃8期李立群等:小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定Copyright©博看网. All Rights Reserved.表1 所用引物T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y用途I t e m引物名称P r i m e r引物序列(5'ң3')S e qu e n c e 初级文库M 13-F (-20)G T A A A A C G A C G G C C A GP r i m a r y l i b r a r y M 13-RC A G G A A A C A G C T A T G A C次级文库pG A D T 7-F T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G C G A G C G C C G C C A T G S e c o n d a r y l i b r a r y pG A D T 7-R G T G A A C T T G C G G G G T T T T T C A G T A T C T A C G A T T诱饵载体B D -D A R 1-1F C A T G G A G G C C G A A T T C A T G G G T T G G T T G A C C A A A T T T T T B a i t v e c t o r B D -D A R 1-1RG C A G G T C G A C G G A T C C T C A G A A C G G C A A T G T C C C T G T C诱饵载体B D -D A R 1-N -F C A T G G A G G C C G A A T T C A T G G G T T G G T T G A C C A A A T T T T T B a i t v e c t o r B D -D A R 1-N -R G C A G G T C G A C G G A T C C T C A A C G A G G G T G T G C A C T A T T T T C 诱饵载体B D -D A R 1-C -FC A T G G A G G C C G A A T T C G C T C G G G A A A A T G G C A G C G B a i t v e c t o rB D -D A R 1-C -RG C A G G T C G A C G G A T C C T C A G A A C G G C A A T G T C C C T G T C注:黑色碱基是酶切位点㊂N o t e :B l a c kb a s em e a ne n d o n u c l e a s e s i t e .表2 文库鉴定P C R 程序T a b l e 2 P C Rr e a c t i o n c o n d i t i o n s f o r i d e n t i f i c a t i o no f l i b r a r y初级文库重组率鉴定R e c o m b i n a t i o n r a t e o f p r i m a r y l i b r a r y次级文库重组率鉴定R e c o m b i n a t i o n r a t e o f s e c o n d a r y l i b r a r y95ħ3m i n35c yc l e s :95ħ40s 58ħ40s 72ħ1m i n 72ħ10m i n95ħ3m i n35c yc l e s :95ħ40s 60ħ40s 72ħ1m i n 72ħ10m i n1.2.3 酵母双杂交文库的构建 (1)酵母感受态细胞的制备及转化㊂酵母感受态细胞制备:取-80ħ保存的酵母(Y 187或Y 2H G o l d )菌株,在超净台划线于含卡那霉素抗性的Y P D A 培养基上进行活化培养,30ħ培养4~5d ㊂当有肉眼可见的菌落时,挑取单菌落(直径2~3mm )于15m L 离心管中,30ħ,160~180r /m i n 振荡培养16~20h ㊂取5μL 培养物到250m L 三角瓶中,加入50m LY P D A 培养基中,30ħ下170r /m i n 培养18~22h ,至O D 600值达到0.3左右㊂6000r /m i n 离心6m i n ,弃上清,用100m L Y P D A 重悬浮菌体,30ħ振荡培养5h 至O D 600达到0.5左右㊂然后将100m L 酵母菌液分装为2管,6000r /m i n 离心6m i n ,弃上清,每管均加入40m L 无菌的d d H 2O ,悬浮沉淀,6000r /m i n 离心5m i n ,再重复一次,去尽上清㊂每管用1.5m L现配的1.1ˑT E /L i A c 溶液悬浮菌体,转移至2m L 离心管,13000r /m i n 离心25s 弃上清,每管加入1.1ˑT E /L i A c 600μL 重悬菌体,即完成感受态细胞的制作㊂中国春小麦c D N A 次级文库质粒转化酵母感受态Y 187:在15m L 无菌的离心管中依次加入次级文库质粒5μg ㊁已变性鲑鱼精20μL ㊁酵母感受态细胞600~1200μL ㊁1ˑP E G /L i A C2500μL ,轻轻混合㊂然后金属浴中30ħ孵育45m i n ,其间颠倒混匀3次㊂在超净台中加入160μL 的D M S O 之后轻轻混匀,在42ħ金属浴中孵育20m i n ,其间轻轻上下颠倒混匀一次㊂酵母转化完成,将离心管室温下6000r /m i n ㊁离心6m i n ㊁弃上清,用1m L Y P D p l u s 重悬细胞,5000r /m i n 离心5m i n ,弃尽上清,再用15m L 质量分数为0.9%N a C l 悬浮细胞以保持细胞正常渗透压,将菌液均匀涂布于70~100个15c m 含有S D /-L e u 营养缺陷培养基上,30ħ,倒置培养4~5d 至菌落长出㊂(2)酵母双杂文库的鉴定:从Y 187菌液中吸取150μL 酵母菌液,分别稀释10㊁100㊁1000倍,吸取100μL 将不同浓度的菌液均匀涂布于15c m ,S D /-L e u 营养缺陷培养基平板上,30ħ,倒置培养4~5d ,待白色菌斑长出,计数并计算文库转化效率㊂酵母文库转化效率(C F U /μg )=(C F Uˑ悬浮液体积ˑ稀释倍数)/[初始涂布体积ˑ转化D N A 数(μg )]㊂待菌落长出后,将涂有Y 187菌株的S D /-L e u 平板放置在4ħ冰箱3~4h ,每平板加5m L 含30%甘油的Y P D A 溶液,将菌落全部刮下,收集到500m L 三角瓶中,估计酵母细胞数目㊂如果细胞数目低于2ˑ107C F U /m L ,浓缩后分装1m L /每管,-80ħ分装保存,即为 m a t i n g文库菌㊂1.2.4 文库的筛选及回转验证 (1)诱饵菌株㊃059㊃西北农业学报31卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.构建:本试验使用同源重组的方法构建B D诱饵表达载体㊂其中,插入B D载体的酶切位点为B a m HⅠ和E c o RⅠ,构建诱饵载体所需引物见表1㊂使用菌落P C R鉴定阳性单菌落,并提取质粒进行酶切,以检测诱饵载体的正确性,然后将B D 诱饵表达载体转化Y2H酵母菌株,并涂布于S D/-T r p营养缺陷平板上㊂30ħ倒置培养4~5d,即为含有B D诱饵表达载体的菌株㊂(2)诱饵菌株的自激活和毒性验证:分别挑取含有B D诱饵表达载体及含有B D空载体的Y2H 单菌落,溶于10μL质量分数为0.9%N a C l溶液中,各吸取1μL菌液,点样在缺体培养基S D/-T r p(一缺)及S D/-T r p-H i s-A d e(三缺)上,30ħ培养4~5d,观察酵母菌的变化㊂如果酵母菌斑能够在2种缺体培养基平板上生长,说明诱饵蛋白具有自激活效应,如果只能在一缺培养基上生长,不能在三缺培养基上生长,则说明无自激活活性㊂分别挑取含有B D诱饵表达载体及含有B D 空载体的Y2H单菌落,将其接种于50m L含有50μg/m L卡那霉素的S D/-T r p液体培养基中,在30ħ㊁250r/m i n的条件下震荡培养18~20 h,并且比较两者的O D600值,从而确定诱饵蛋白的表达是否对酵母细胞有毒性㊂如果无毒性,含有B D诱饵表达载体Y2H菌株的生长速度与含有B D空载体Y2H菌株的生长速度相近㊂如果有毒性,含有B D诱饵表达载体Y2H菌株的生长会受到抑制,其O D600值小于含有B D空载体Y2H菌株O D值㊂(3)文库的筛选:参考C l o n t e c h酵母双杂文库说明书,采用 m a t i n g 的方法进行文库筛选㊂当文库菌与诱饵菌杂交后,显微镜下可观察到酵母合子细胞,即视野中出现米老鼠头像或者三叶草图像,说明酵母杂交成功㊂常温下5000r/m i n 离心8m i n收菌,用质量分数为0.9%N a C l重悬菌体,涂四缺平板培养基S D/-T r p/-L e u/-A d e/-H i s,30ħ倒置培养5d,观察酵母生长情况㊂挑取四缺平板上的酵母菌斑,点在含有40μg/m L X-α-g a l和200n g/m L A b A的四缺平板上,若酵母能正常生长且变蓝,即为酵母双杂交阳性菌㊂(4)回转验证:使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母双杂交阳性菌的质粒,转化大肠杆菌(D H5α感受态),根据A m p的抗性分离质粒得到只转入A D-p e r y载体的菌斑,抽提质粒并测序,通过比对N C B I数据库初步确定可能的互作基因㊂从中国春小麦c D N A中获取该基因的全长序列,并将其接入A D载体㊂再将连接互作基因全长的A D质粒和诱饵质粒一起回转到Y2H酵母菌中,将转化的菌株涂在D D O二缺平板及Q D O四缺平板,观察它在30ħ㊁3~5d内是否生长㊂假如在2种营养缺陷型平板均有生长,说明下游报告基因被激活,也就证明转入的2种片段之间存在互作关系;假如只在二缺平板上生长,说明报告基因没有被激活,二者没有互作关系㊂2结果与分析2.1R N A的提取及m R N A检测采用T r i z o l法分别提取中国春小麦叶片㊁幼茎㊁幼穗和花后不同时期嫩籽粒的总R N A,电泳检测条带清晰,28S与18S的亮度比接近2ʒ1,说明总R N A完整性良好(图1-A)㊂m R N A分离纯化后,电泳质检得到弥散状条带,且弥散状高亮度区集中在大分子量区域1000k b以上(图1-B),符合构建文库的要求㊂A.总R N A(1-4分别是叶片,幼穗,幼茎,花后不同时期小麦籽粒的R N A样品);B.纯化的m R N AA.E l e c t r o p h o r e s i s o ft o t a l R N A f r o m d i f f e r e n tt i s s u e s;B.P u r i f i e dm R N Aa n d M2000图1中国春小麦总R N A和m R N A的电泳图F i g.1A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t o t a lR N Aa n di s o l a t e dR N Ao fC h i n e s e S p r i n g w h e a t2.2初级文库的构建及鉴定将纯化后的m R N A反转录成c D N A后,进行B P重组反应㊂将反应物电转至D H10B获得中国春小麦c D N A初级文库菌液㊂取10μL初级文库菌液稀释1000倍,从中取50μL涂布含有卡那霉素的L B平板,37ħ过夜培养,平板上的克隆数为912(图2),(平板上的克隆数/50μL)ˑ㊃159㊃8期李立群等:小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定Copyright©博看网. All Rights Reserved.稀释倍数ˑ1000μL =912/50μL ˑ1000ˑ1000μL =1.82ˑ107C F U /m L ,即大肠杆菌文库菌液库容量为1.82ˑ107C F U /m L ㊂抽提初级文库质粒,并转化D H 5α㊂随即挑选24个单克隆经P C R 检测,结果由图3可知,插入片段平均长度在1k b 以上,重组率大于96%,符合初级文库的质量需求㊂2.3 次级文库的构建及质量鉴定将抽提的初级文库质粒经L R 重组反应后,电转化D H 10B 获得次级文库菌液㊂取10μL 次级文库菌液稀释1000倍涂布含有A m p 抗性的L B 平板㊂结果如图4所示,平板克隆数为956,经计算,次级文库容量为(平板上的克隆数/50μL )ˑ稀释倍数ˑ1000μL=956/50μLˑ1000ˑ1000μL =1.91ˑ107C F U /m L ㊂抽提次级文库菌液并转化D H 5α,由菌落P C R 结果(图5),可见插入片段大小都在1k b 以上,重组率>96%,达到次级文库的构建标准㊂由此可见,经B P 重组反应及L R 重组反应构建的中国春小麦c D N A 文库连接效率高,库容量大㊂图2 初级文库平板鉴定库容量图(克隆数912)F i g .2 I d e n t i f i c a t i o no f p r i m a r y l i b r a r yt o t a l c l o n e s (912c l o n e s)图3 初级文库插入片段重组率鉴定图F i g .3 P C Ri d e n t i f i c a t i o no f p r i m a r y l i b r a ry图4 次级文库平板鉴定库容量图(克隆数956)F i g .4 I d e n t i f i c a t i o no f s e c o n d a r y l i b r a r yt o t a l c l o n e s (956c l o n e s)2.4 酵母双杂文库的鉴定将中国春小麦c D N A 次级文库转化Y 187菌株,获得酵母双杂交文库㊂本试验共转化次级文库质粒6μg,总悬浮体积11.5m L ,稀释100倍后,取100μL 涂平板统计长出的平均酵母菌克隆数为103,计算得酵母文库转化效率约为1.97ˑ105C F U /μg ,超过 m a t i n g 酵母文库转化效率标准(1ˑ105C F U /μg )㊂吸取浓缩后的100μL 酵母双杂交文库菌液,稀释10000倍,涂平板培养长出平均为204个克隆,经计算得酵母双杂交文库容量为2.04ˑ107C F U /m L ,超过m a t i n g 酵母文库标准(1ˑ107C F U /m L )㊂2.5 文库的筛选及回转验证2.5.1 T a D A R 1诱饵载体的构建经过对菌液P C R 鉴定的阳性克隆进行测序,序列分析结果与粒质量基因T a D A R 1的序列完全一致,同时质粒提取酶切验证结果与预期结果一致,酶切后各片段大小与预期相符(图6)㊂表明诱饵表达载体构㊃259㊃西北农业学报31卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.建正确,符合酵母双杂交文库筛选的要求,能够进行后续研究㊂2.5.2诱饵菌株自激活与毒性验证由图7可知,全长的T a D A R1有自激活活性,因此根据T a D A R1蛋白结构域将其截断为N端和C端两部分,并分别构建B D-T a D A R1-N和B D-T a-D A R1-C载体㊂转化Y2H菌株后发现,B D-T a-D A R1-N无自激活活性,表明T a D A R1激活域在图5次级文库插入片段重组率鉴定图F i g.5P C Ri d e n t i f i c a t i o no f s e c o n d a r y l i b r a r y蛋白的C端㊂因此选择B D-T a D A R1-N作为诱饵载体进行后续试验㊂同时,发现转化诱饵质粒B D-T a D A R1-N的Y2H菌液与转化B D空载菌液的生长速度相近,说明诱饵载体对酵母细胞没有毒性,不会影响文库的筛选㊂2.5.3文库筛选诱饵菌与文库菌m a t i n g后显微镜下观察,有典型的三叶草图形,即酵母合子细胞出现(图8),表明酵母杂交成功,可进行后续试验㊂2.5.4回转验证本研究随机挑选3个阳性克隆,抽提质粒后测序,发现其中一个编码蛋白提前终止,为无效片段;另外两个阳性克隆测序序列一图6诱饵载体酶切后电泳图F i g.6F r a g m e n t s o f v e c t o r a f t e r e n z y m e d i g e s t i on1.p G B K T7(B D);2.B D-T a D A R1-N;3.B D-T a D A R1;4.B D-T a D A R1-C图7诱饵表达载体酵母Y2H自激活验证图F i g.7S e l f-a c t i v a t i o nd e t e c t i o no f b a i t v e c t o r致,经比对数据库(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/,h t t p s://p l a n t s.e n s e m b l.o r g/)后,将其命名为T a D A R1I P(T r a e s C S3B02G548700.1),该氨基酸全长329a a,在蛋白N端含有M y b_D N A-b i n d_3结构域(图9)㊂构建A D-T a D A R1I P载体同B D-T a D A R1-N回转Y2H菌株,结果含有全长的T a D A R1I P与T a D A R1-N的菌株在D D O和Q D O培养基上生㊃359㊃8期李立群等:小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定Copyright©博看网. All Rights Reserved.长良好,在Q D O /X /A 长出蓝斑(图10)㊂结果说明T a D A R 1与T a D A R 1I P 确实存在相互作用,进一步证明利用本方法构建的酵母双杂交文库切实有效㊂3 讨论构建高质量的酵母双杂交文库是大规模筛选候选互作蛋白的基础[27]㊂本研究提取了中国春小麦叶片,幼茎㊁幼穗及花后不同发育时期籽粒的总R N A ,并将其混合后用于构建酵母双杂交c D -N A 文库,有效地防止了文库中组织特异性表达基因的丢失[14,28]㊂彭晓珏等[29]研究表明利用g a t e w a y 技术方法构建c D N A 文库,不需要传统的酶解和连接过程,能够较大程度地避免低拷贝数基因克隆的丢失,保证了文库的质量和忠实性㊂王舟等[30]㊁李晨等[31]研究证明g a t e w a y 位点特异性重组技术作用显著,通过B P 高效重组技术,可以保证材料中m R N A 的原始丰度在文库中得到真实的反映,通过L R 反应,可以迅速地将目的基因定向重组到各种表达系统如酵母㊁细菌中,可以高效准确进行基因的表达分析㊂该方法克服了传统技术中难获得大片段克隆的问题,具有无可比拟的优势㊂虽然成本稍高,但是更适用于基因组庞大复杂的小麦等作物应用㊂本研究构建的小麦c D NA图8 酵母杂交细胞观察F i g .8 O b s e r v a t i o no f y e a s t z y go te 图9 T a D A R 1I P 蛋白序列示意图F i g .9 S e qu e n c e o fT a D A R 1I P p r o t e in 图10 T a D A R 1I P 与T a D A R 1互作示意图F i g.10 I n t e r a c t i o nv a l i d a t i o no fT a D A R 1a n d i t s c a n d i d a t e p r o t e i nT a D A R 1I P ㊃459㊃西北农业学报31卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.文库具有107C F U/m L库容,插入片段平均长度在1000b p以上,表明文库覆盖度高且完整性好,文库构建成功㊂构建的中国春小麦酵母双杂交文库,转化效率为1.97ˑ105C F U/μg,文库容量2.04ˑ107C F U/m L,达到小麦酵母双杂文库的较高要求,可以最大程度地筛选到所有的与靶蛋白具有相互作用的蛋白质分子㊂方玉楷等[32]已证明m a t i n g法筛选互作蛋白比常用的共转化法效率高㊂本实验室利用本研究构建的中国春小麦酵母双杂文库已经筛选获得8个抗逆基因和一个粒质量基因的互作蛋白,2个已通过功能验证[33-34],其余基因功能正在进行研究㊂由此可见本研究构建的中国春小麦c D N A 文库质量良好㊂使用m a t i n g法筛选酵母双杂交文库,可以筛选出与诱饵蛋白互作的蛋白[35]㊂但有时候某些基因诱饵蛋白有自激活作用,会导致假阳性的存在,致使结果不准确[36]㊂针对此问题,进行文库筛选前,要对重组质粒转入酵母感受态细胞中有无自激活活性进行检测㊂如果诱饵载体无自激活现象,可直接应用于文库筛选互作蛋白;如果有自激活现象,必须对基因进行截断检测,确定不包含激活的区域,然后才能作为诱饵进行文库筛选,本研究就是一个典型的范例㊂另一方面,为排除假阳性带来的试验干扰,保证试验结果的真实㊁严谨,还必须结合B i F C㊁G S TP u l l-d o w n㊁C o I P等试验技术来进一步验证基因的互作关系㊂4结论本研究以中国春小麦叶㊁茎㊁幼穗及花后不同时期的籽粒为材料,利用G a t e w a y技术成功构建了中国春小麦酵母双杂交文库,库容大覆盖面广㊁质量高㊂通过m a t i n g法筛选互作蛋白,筛选效率高㊂通过小麦粒质量基因T a D A R1互作蛋白的筛选和验证,表明构建的酵母文库是高质量的㊁有效的㊂研究为初学者构建酵母双杂文库及使用 m a t i n g 法筛选酵母文库提供借鉴㊂同时,文库的建立也为后续小麦基因功能的研究奠定了基础㊂参考文献R e f e r e n c e:[1] C A OS,Y A NLL.C o n s t r u c t i o n o f a h i g h-q u a l i t y y e a s t t w o-h y b r i d(Y2H)l i b r a r y a n d i t s a p p l i c a t i o n i n i d e n t i f i c a t i o no fi n t e r a c t i n g p r o t e i n s w i t h k e y v e r n a l i z a t i o n r e g u l a t o rT a V R N-A1i nw h e a t[J].B M CR e sN o t e s,2013,6:81.[2]王婷,葛怀娜,郭宏.酵母双杂交技术应用进展[J].生物技术进展,2015,5(5):392-396.WA N G T,G E H N,G U O H.P r o g r e s so na p p l i c a t i o no fy e a s t t w o-h y b r i dt e c h n i q u e[J].C u r r e n t B i o t e c h n o l o g y, 2015,5(5):392-396.[3]邱牡丹,李莉,李懿星,等.水稻穗发育相关基因酵母双杂交c D N A文库的构建[J].基因组学与应用生物学,2018, 37(10):4322-4328.Q I U M D,L IL,L IY X,e ta l.C o n s t r u c t i o no f y e a s t t w o-h y b r i dc D N A l i b r a r y o fr i c e p a n i c l e d e v e l o p m e n t-r e l a t e dg e n e[J].G e n o m i c sa n d A p p l i e d B i o l o g y,2018,37(10):4322-4328.[4]郑凯,曲延英,倪志勇,等海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与G b T C P5互作蛋白的筛选[J].核农学报, 2019,33(10):1928-1939.Z H E N G K,Q U Y Y,N I Z H Y,e t a l.C o n s t r u c t i o no f y e a s t t w o-h y b r i dn o r m a l i z e d c D N A l i b r a r y a n d s c r e e n i n g o f i n t e r-a c t i o n p r o t e i n so fGb T C P5i n G o s s y p i u mb a r b a d e n s e f i b e r[J].J o u r n a lo f N u c l e a r A g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,2019,33(10):1928-1939.[5]羊海珍,顿珠加布,徐齐君.青稞白粉菌诱导酵母双杂文库的构建及HV U L0H33228.2互作蛋白的筛选[J/O L].分子植物育种:1-12[2021-11-28].h t t p s://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/46.1068.S.20210423.1822.034.h t m l.Y A N G HZ H,D U NZ HJB,X U QJ.C o n s t r u c t i o no f y e a s t t w o-h y b r i d c D N Al i b r a r y o f t i b e t a nh u l l e s sb a r l e y i n d u c e db y p o w d e r y m i l d e w a n dsc r e e n i n g o f p r o t e i n si n t e r a c t e dw i t h H V U L0H33228.2[J/O L].M o l e c u l a r P l a n tB r e e d-i n g.1-12[2021-11-28].h t t p s://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/46.1068.S.20210423.1822.034.h t m l.[6]张恒,陈怡名,张旭,等.白粉菌诱导簇毛麦叶片酵母双杂交文库构建及C M P G1-V互作蛋白筛选[J].南京农业大学学报,2020,43(4):594-604.Z H A N G H,C H E N Y M,Z HA N G X,e t a l.C o n s t r u c t i o no f y e a s t t w o-h y b r i d c D N A l i b r a r y o f H a y n a l d i a v i l l o s a l e a v e si n d u c e db y p o w d e r y m i l d e w a n ds c r e e n i n g o fi n t e r a c t i o np r o t e i n so fC M P G1-V[J].J o u r n a lo f N a n j i n g A g r i c u l-t u r a lU n i v e r s i t y,2020,43(4):594-604.[7]李颖波,宗营杰,刘成洪,等.盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定[J].上海农业学报,2019,35(6):1-5.L IY B,Z O N G Y J,L I U C H H,e ta l.C o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f y e a s t t w oh y b r i d l i b r a r y o f b a r l e y u n d e r s a-l i n i t y s t r e s s[J].A c t a A g r i c u l t u r a e S h a n g h a i,2019,35(6):1-5.[8]吴耀荣,赵双宜,夏光敏.小麦幼叶c D N A文库的构建[J].山东大学学报,2003,38(2):100-104.WU Y R,Z HA O S H Y,X I A G M.C o n s t r u c t i o no f c D N A l i b r a r y i nw h e a t l e a v e s[J].J o u r n a l o f S h a n d o n g U n i v e r s i-t y,2003,38(2):100-104.[9]谷思,刘璐,李安然,等.草莓果实酵母双杂交文库的构建及F v M4K1互作蛋白的筛选[J].园艺学报,2021,48(6):1067-1078.G US,L I U L,L IA R,e t a l.C o n s t r u c t i o no f y e a s t t w oh y-b r i d l i b r a r y a n d sc r e e n i n g o f F v M4K1i n t e r a c t i n gp r o t e i n i nt h e f r u i t o f F r a g r a r i av e s c a[J].A c t a H o r t i c u l t u r a eS i n i-c a,2021,48(6):1067-1078.[10]郑巧玲,申威,姚文孔,等.山葡萄低温诱导酵母双杂三框c D N A文库构建和V a C I P K18互作蛋白筛选鉴定[J].园艺学报,2020,47(12):2301-2316.Z H E N G QL,S H E N W,Y A O W K,e t a l.C o n s t r u c t i o no fy e a s t t w o-h y b r i d t h r e e-f r a m e c D N Al i b r a r y o f V i t i s a m u-r e n s i s a n d s c r e e n i n g o fV a C I P K18i n t e r a c t i o n p r o t e i n[J].A c t a H o r t i c u l t u r a eS i n i c a,2020,47(12):2301-2316.㊃559㊃8期李立群等:小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定Copyright©博看网. 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一种抑制二型糖尿病的酵母β-葡聚糖及其制备方法和用途[发明专利]

专利名称：一种抑制二型糖尿病的酵母β-葡聚糖及其制备方法和用途
专利类型：发明专利
发明人：许小娟,曹燕
申请号：CN201410411673.6
申请日：20140820
公开号：CN104371038A
公开日：
20150225
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种水不溶性面包酵母葡聚糖，其结构为线型β-(1→3)-D葡聚糖。

其制法是，将市售酵母葡聚糖粉末用水提取，离心；取残渣在室温下用NaOH水溶液提取，离心收集上清液；上清液中和后离心收集沉淀，沉淀经脱色、水透析和冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖。

本发明酵母β-葡聚糖能显著降低二型糖尿病小鼠的体重、血糖以及肝脏中脂肪、胆固醇的堆积，促进肝糖原合成，可用于抑制二型糖尿病药物或保健品的制备。

申请人：武汉大学
地址：430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学
国籍：CN
代理机构：武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：汪俊锋
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酵母双杂实验步骤

酵母双杂实验步骤2.1.1酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。

其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。

获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μLpDONR221 (150 ng/μL)1μLTE buffer, pH 8.0 补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP 反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P入门载体；(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。

酵母双杂交及其衍生系统_黄欣媛

・技术与方法・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第1期生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。

1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two -hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。

本文对Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。

1 酵母双杂交系统的原理酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA 结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动收稿日期：2013-08-03基金项目：特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）作者简介：黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：huangxycn@酵母双杂交及其衍生系统黄欣媛1 范红波2（1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000）摘要：酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。

对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。

关键词：酵母双杂交系统蛋白质相互作用双杂交技术体系The Yeast Two -Hybrid System and Its Several Derived SystemsHuang Xinyuan 1 Fan Hongbo 2（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables ，Hubei Engineering University ，Xiaogan 432000；2.HubeiPolytechnic Institute ，Xiaogan 432000）Abstract: The Yeast two -hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein -protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two -hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein -ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques.Key words: Yeast two -hybrid（Y2H）system Protein -protein interaction Two -hybrid methodology system子区域从而激活基因的转录。

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1、假阳性较多：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。
原因：
（1）BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。（2）AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是
后者带来许多假阳性。
措施：（1）作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。（2）采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。（3）报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。（4）优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。

细胞学方法
--双分子荧光互补实验（BiFC） --荧光共振能量转移（FRET）
酵母双杂系统
概述
基本原理实验流程优缺点及应用

酵母双杂交系统的建立，基于真核生物调控转录起始需要有转录激活因子的参与。
真核转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个（或以上）相互独立的结构域构成： -- DNA结合结构域（DNA binding domain，BD） -- 转录激活结构域（activation domain，AD）。这两个结构域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录。
Prey
pDEST22-cDNA library
BP反应
LR反应
实验流程
￭质粒构建
pDEST32-bait 转化大肠杆菌感受态
挑阳性克隆进行菌落PCR
送测序
测序正确提取质粒

酵母感受态细胞制备（现用现制备） pDEST32-bait 转化酵母感受态细胞MaV203

涂布SC-leu单缺平板菌落PCR挑选正确克隆备用

pDEST32-bait & pDEST22（空）共转化酵母；涂布培养基 SC-Leu-Trp-His（含3-AT）

含pDESTry转化酵母感受态涂布SC-Leu-Trp-His+3AT平板（30-50个）
Growth in medium lacking Ura. No growth in medium adding 5FOA Blue in medium containing X-gal. Growth in medium lacking His (usually need to add 3AT to increase selectivity).

自激活：在没有蛋白互作情况下，转录激活（BD-X+AD）约有25%的baits可引起自激活酵母菌株MaV203具有 HIS3 基础水平表达，而HIS3 表达产生的参与组氨酸生物合成的酶，受3-Amino1,2,4-Triazole (3AT) 特异性抑制，因此一定浓度3-AT 可提高报告基因 HIS3 的敏感性。

PEG/ LiAc法转化酵母（试剂具体作用）

PEG是一种高分子聚合物, 在酵母转化中起到在高浓度LiAc环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过度损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性 DNA 。 DMSO增加细胞通透性以增加转化效率。鲑鱼精carrier DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精carrier DNA 在转化实验体系中以单链形式存在。
不互作

3个报告基因，4种表型

酵母prey质粒提取，转化E.coli BsrGⅠ酶切检测
测序（确定阅读框准确性）
Blast 确定互作蛋白

确定 cDNA insert （prey）的阅读框，及其与 GAL4 AD ORF 的连续性. 多个阳性克隆编码的是同一个蛋白，是一个很好的指标
注意

取100ul共转样品，稀释1：100&1：1000后涂布SC-Leu-Trp平板用于计算转化效率，要求克隆数高于106

挑选明显（可能的）阳性克隆后续验证

对照质粒的使用（基于Krev1 和RalGDS的互作）
RalGDS wt 强互作
Krev1
RalGDS m1
RalGDS m2
弱互作
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 3、筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein
Linkage Map）
2、阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。
原因：（1）融合蛋白的表达对细胞有毒性。（2）蛋白间的相互作用较弱。（3）蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入细胞核。
措施：（1）选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体（2）应选择高敏酶切检测、测序 ---再转化（降低细胞数、检验互作特异性）

序列比对，确定互作蛋白
实验流程
￭质粒构建
attL1 – bait - attL2
Bait
pDEST32-bait
实验流程
￭质粒构建
attL1 - prey- attL2
注意

所有载体和插入序列的接头处，序列一定要确保阅读框的正确性
主讲人：吴晓萌亓守美卢凡

蛋白互作--why&研究方法讲述分工

蛋白质经常以大型、多亚基的复合物起作用 --核糖体、酶我们可以通过了解一个蛋白与其他蛋白的相互联系来推测该蛋白的功能。

遗传学方法
--酵母双杂（Yeast two-hybrid system）

生化方法
--免疫共沉淀（Co-ip） --Tag pull down --亲和纯化-质谱（AP-MS）
酵母GAL4转录因子
转录激活结构域(AD)
(activation domain)
AD DBD
GAL4 UAS
Promotor
Reporter gene
Expression of reporter gene
A bait (fused to BD)
ADADAD ADBD GAL 4 UAS
AD Promoter Reporter gene
AD
A library of cDNAs fused to AD
A prey interacting with the bait
AD
BD GAL 4 UAS
Promoter Reporter gene
Expression of reporter gene
Invitrogen ProQuest™ Two-Hybrid System

在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。二者共转化酵母菌株，若X与Y蛋白有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活酵母下游报告基因表达。
DNA结合结构域(DBD) (DNA binding domain)
Bait plasmid
Reporter 1 Ura
Reporter 2 LacZ prey plasmid
Reporter 1 His 诱饵质粒构建，选择诱饵质粒转化酵母菌株MaV203
隆检测报告基因表达验证互作

经典验证 (但是费时): 交换诱饵和猎物重新检测
用其他系统验证互作，如co-immunoprecipitation.

1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。 2、双杂交系统的敏感度极高，许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。