Westernblot实验步骤及注意事项1(精)
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WB实验步骤
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
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Westernblot实验步骤及注意事项Westernblot 实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。
注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制O SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理O 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)。
O 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳O 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
O 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
O 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。
为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
O 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)O 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。
硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
O 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
O 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
O 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)O 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
O 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。
在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)O 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
O 用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
O 回收一抗。
加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)O 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
O 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
O 回收二抗。
加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)O 参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
O 洗片时可以使用X光片自动洗片机。
如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)O 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。