D-hank's液配制

Dhank's液配制

胰酶配方10×D-Hank’s液 100mL单蒸水 900mL0.5M/L EDTA 10ML胰酶（粉末） 4g用1 M NaOH 调节pH 至7.2-7.4PH调完后用0.22 um的滤器过滤除菌（注：10×D-Hank’s液先稀释成1×，调PH 7.2，再加入胰酶粉末，最后再调pH）1×Hank’s液配方NaCl 8gKCl 0.4gCaCl20.14gMgSO4·7H2O 0.2gNa2HPO4·H2O 0.06gKH2PO40.06gNaHCO30.35gGlucose 1.00g酚红 0.02g加水至1L，用NaHCO3调pH 7.2-7.4(0.22 um 滤膜过滤除菌)20×D-Hank’s液配方NaCl 160gKCl 18gNa2HPO4·12H2O 3.04gKH2PO41.2gGlucose 20g 1%酚红 40mL加水至1L，10pM，10min；7.5% Na2CO3调pH 7.2-7.4RPMI1640 配方RPMI1640粉末 10.4gHEPES 4.67gL-G 2 m mol/L，0.292g2-ME（2-巯基乙醇） 1×10-5 mol/L丙酮酸钠 1 m mol/L（0.11g/L）PNC（青霉素） 100IUSM（链霉素） 100IUO 约800mLDH2磁力搅拌3-4小时，充分溶解；用NaHCO约2g，调pH至7.2-7.43DHO加至1000 mL混匀，0.22 um滤器过滤除菌，分装，-20度保存2附：0.01mol/L 2-ME配制：取7 mL 2-ME加入93mL双蒸水（1mol/L）,再取1mol/L O至50mL，即成（即：万分之七）。

即70uL至100mL，临时用2-ME0.5mL加ddH2每1L 1640取1mL。

DMEM 配方DMEM粉末 10.4gHEPES 4.67gL-G 2 m mol/L，0.292g2-ME（2-巯基乙醇） 1×10-5 mol/L丙酮酸钠 1 m mol/L（0.11g/L）PNC（青霉素） 100IUSM（链霉素） 100IUDHO 约800mL2磁力搅拌3-4小时，充分溶解；用NaHCO约2g，调pH至7.2-7.43DHO加至1000 mL混匀，0.22 um滤器过滤除菌，分装，-20度保存2。

d-hanks胰酶溶液配置

r:bioer Hits: Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。

D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。

BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。

胰蛋白酶溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。

传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。

胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。

胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。

胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。

一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。

但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。

胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。

溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks 液。

当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。

细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。

用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。

材料：3000 mL锥形瓶，25 mL、50 mL试剂瓶，500 mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。

药品：NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，KCl，酚红，NaHCO3，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgSO4·7H2O，酚红(0.1%)(配法：称酚红2 g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHCO3溶液使最终体积为100 mL。

瓶装保存，备用)。

仪器：抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。

胰酶配方10×D-Hank’s液 100mL单蒸水 900mL0.5M/L EDTA 10ML胰酶（粉末） 4g用1 M NaOH 调节pH 至7.2-7.4PH调完后用0.22 um的滤器过滤除菌（注：10×D-Hank’s液先稀释成1×，调PH 7.2，再加入胰酶粉末，最后再调pH）1×Hank’s液配方NaCl 8gKCl 0.4gCaCl20.14gMgSO4·7H2O 0.2gNa2HPO4·H2O 0.06gKH2PO40.06gNaHCO30.35gGlucose 1.00g酚红 0.02g加水至1L，用NaHCO3调pH 7.2-7.4(0.22 um 滤膜过滤除菌)20×D-Hank’s液配方NaCl 160gKCl 18gNa2HPO4·12H2O 3.04gKH2PO41.2gGlucose 20g 1%酚红 40mL加水至1L，10pM，10min；7.5% Na2CO3调pH 7.2-7.4RPMI1640 配方RPMI1640粉末 10.4gHEPES 4.67gL-G 2 m mol/L，0.292g2-ME（2-巯基乙醇） 1×10-5 mol/L丙酮酸钠 1 m mol/L（0.11g/L）PNC（青霉素） 100IUSM（链霉素） 100IUO 约800mLDH2磁力搅拌3-4小时，充分溶解；用NaHCO约2g，调pH至7.2-7.43DHO加至1000 mL混匀，0.22 um滤器过滤除菌，分装，-20度保存2附：0.01mol/L 2-ME配制：取7 mL 2-ME加入93mL双蒸水（1mol/L）,再取1mol/L O至50mL，即成（即：万分之七）。

即70uL至100mL，临时用2-ME0.5mL加ddH2每1L 1640取1mL。

DMEM 配方DMEM粉末 10.4gHEPES 4.67gL-G 2 m mol/L，0.292g2-ME（2-巯基乙醇） 1×10-5 mol/L丙酮酸钠 1 m mol/L（0.11g/L）PNC（青霉素） 100IUSM（链霉素） 100IUDHO 约800mL2磁力搅拌3-4小时，充分溶解；用NaHCO约2g，调pH至7.2-7.43DHO加至1000 mL混匀，0.22 um滤器过滤除菌，分装，-20度保存2。

D-Hanks平衡盐溶液(含酚红)

D-Hanks平衡盐溶液(1×,含酚红)产品简介：平衡盐溶液（Balanced Salt Solution，BSS）与细胞生长状态下的pH值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中，细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。

平衡盐溶液（BSS）主要由无机离子组成，有时含有碳酸氢钠、葡萄糖、酚红等，如果有必要还可以加入HEPES，加入少量的HEPES后，可以减少氯化钠的加入量，以维持渗透压的平衡。

平衡盐溶液可以作为完全培养基的基液，亦可以用于稀释浓缩的氨基酸、维生素溶液以配制完全培养基。

BBS配方常有改动，如Hank’s BBS由不含钙镁或酚红的，也有含钙镁含酚红的等等, Dulbecco’s PBS由不含钙镁或含钙镁的等。

HBSS、EBSS、PBS等都是与较弱的磷酸盐缓冲液相关的盐溶液。

常见的平衡盐溶液有Eargle液，Hanks’液、低钙镁和无钙、镁平衡盐溶液及磷酸盐缓冲液 (PBS)等。

D-Hanks平衡盐溶液是最常用的磷酸盐缓冲溶液之一，又称CMF-Hanks' Balanced Salt Solution、CMF-HBSS溶液或D-Hanks’ BSS, 主要由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、葡萄糖等组成，不含钙离子和镁离子，pH值一般为7.2～7.4。

Leagene D-Hanks平衡盐溶液(1×,含酚红)，不含钙离子和镁离子，含酚红，用重蒸超纯水配制，pH值7.4，经严格过滤除菌处理，内毒素含量低，可用于胰蛋白酶和EDTA 细胞消化液等各种无或低钙镁细胞培养用液的配制，组织和细胞的漂洗等。

主要成分：主要由 KCl、KH2PO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、葡萄糖等组成，含少量酚红。

操作步骤（仅供参考）：1、无需配制，直接使用。

注意事项：1、在进行细胞培养过程中细胞的洗涤时，应注意无菌操作，避免被微生物污染。

hanks液配制细胞培养技术

Hanks液的配制：①NaCl 8克、KCl 0.4克、MgSO47H2O 0.1克、MgCl·6H2O 0.1克溶于800毫升重蒸馏水中；②CaCl2(无水)0.14克溶于100毫升重蒸馏水中；③葡萄糖1.0毫克、NaHPO4 0.154克、KH2PO4 0.06克、0.4%酚红液5毫升溶于100毫升重蒸馏水中。

将上述3种溶液混和，8磅30分钟灭活菌，或用玻璃滤器过滤。

保存在5℃备用，用前以5%NaCO3调pH。

细胞培养技术（一）一.细胞培养的基本原理细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。

细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。

细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。

在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。

培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。

在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。

细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。

通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。

如心肌组织中心肌细胞约占50％，非心肌细胞占50％；而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95％以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。

在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程；用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象；还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。

Hanks平衡盐溶液(5×HBSS,无酚红)

Hanks 平衡盐溶液(5×HBSS,无酚红)简介：平衡盐溶液(Balanced Salt Solution ，BSS)与细胞生长状态下的pH 值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。

主要由无机离子组成，有时含有碳酸氢钠、葡萄糖、酚红等，如果有必要还可以加入HEPES 以维持渗透压的平衡。

BBS 配方常有改动，如Hank's BBS 有不含钙镁或酚红的，也有含钙镁含酚红的等等, Dulbecco's PBS 有不含钙镁或含钙镁的等。

HBSS 、EBSS 、PBS 等都是与较弱的磷酸盐缓冲液相关的盐溶液。

常见的平衡盐溶液有Eargle's 液、Hank's 液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)等。

Hanks 平衡盐溶液是最常用的磷酸盐缓冲溶液之一，又称Hanks' Balanced Salt Solution 、Hanks' BSS 、HBSS, 主要由氯化钠、氯化钾、磷酸盐、碳酸氢钠、葡萄糖等组成，含Ca 2+、Mg 2+、酚红。

Leagene Hanks 平衡盐溶液(5×,无酚红)，含Ca 2+、Mg 2+，不含酚红，用重蒸超纯水配制，pH 值7.4，经严格过滤除菌处理，内毒素含量低，可用于胰蛋白酶-EDTA 细胞消化液等各种无或低钙镁细胞培养用液的配制以及组织和细胞的漂洗等。

该试剂为浓缩液，使用之前应稀释。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、进行细胞培养过程中细胞的洗涤时，5×HBSS 溶液:无菌水按一定比例进行稀释，即取5×HBSS 溶液、无菌水，充分混匀，即获得HBSS 工作液。

2、进行常规实验（不要求无菌）时，5×HBSS 溶液：双蒸水或去离子水按一定的比例进行稀释，即取5×HBSS 溶液、双蒸水或去离子水，充分混匀，即获得HBSS 工作液。

Hank's液和D-Hank's液

Hank's液和D-Hank's液
Hank's液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。
Hanks液的配制
Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液（Balanced Salt Solutio,），简称H。主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。
将（1）液和（2）液混合，补加双蒸水至1000ml，即为原液B。
应用液
原液A
1份
原液B
1份
双蒸水
18份
混合后，分装于200ml小瓶中，10磅高压蒸气灭菌15分钟，临用前用无菌的5.6% NaHCO3调pH至7.2~7.6
D-Hank’s的配制
D-Hank's与Hank's的一个主要区别在于前者不含有钙和镁离子，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。
D-Hank’s
NaCl
8g
KCl
0.4g
Na2HPO4·12H2O
0.152g
KH2PO4
0.06g
NaHCO3
0.35g
溶于800ml双蒸水
1．依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后调PH至7.2。
2．定容至1000mL。
3．高压灭菌，10磅10min。
原液A
NaCl
160g
MgSO4·7H2O
2g
KCl
8g
Mg Cl2·6H2O
2g
CaCl2
2.8g
溶于1000ml双蒸水
原液B
（1）
Na2H4
1.2g
葡萄糖
20.0g
溶于800ml双蒸水

hanks液的配制

Hanks 液的配制
Hanks 液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液（Balanced Salt Solutio, ），简称H。主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。
原液A
NaCl
160g
MgSO4·7H2O
2g
KCl
8g
Mg Cl2·6H2O
2g
CaCl2
溶于1000ml双蒸水
原液 B
（1）
Na2HPO4·12H2O
KH2PO4
葡萄糖
溶于800ml双蒸水
（2）
%酚红溶液：取酚红，置玻璃研钵中，逐滴加入 NaOH，并研磨，直至完全溶解，约加 NaOH 10ml。将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。
CaCL2
KH2PO4
NaHCO3
葡萄糖
酚红
加水至1L，用NaHCO3调PH至~
将（1）液和（2）液混合，补加双蒸水至1000ml，
双蒸水
18份
混合后，分装于200ml小瓶中，10磅高压蒸气灭菌15分钟，临用前用无菌的% NaHCO3调pH至~
Hank's液配方(g/L)------- 来自司徙镇强主编〈细胞培养〉（P41页）
NaCL
KCL