四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究

收稿日期:2008201202;修回日期:2008207202基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET 20520785);四川省科技平台项目(07PT 203);四川大学大学生创新性实验计划项目作者简介:汪红(1961-),女,工程师,主要研究方向为微生物学.通讯作者:乔代蓉.E 2mail :qiaodr @文章编号:　049026756(2008)0621509204四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究汪　红,曹　瑜,罗时宇,吴航静,刘　芳,曹　毅,乔代蓉(四川大学生命科学学院四川省生物信息与代谢工程共享实验平台,成都610064)摘　要:以6种四川泡菜汁为材料,分离到11株菌,均为革兰氏阳性菌株,接触酶实验呈阴性.从中筛选出一株产酸能力强、生长速度快的菌株,菌株编号为070826221.采用乳酸定性分析测出该菌发酵产物为乳酸.之后经Biolog 微生物鉴定仪进一步鉴定,确定该菌株为L acto 2coccus lactis.该菌株的最适生长p H 为5～7,最适生长温度为30℃,最适生长盐浓度为0～5%.关键词:四川泡菜;乳酸菌;分离鉴定中图分类号:Q93 文献标识码:AIsolation ,identif ication and characteristics of lactic acidbacteria from sichuan picklesW A N G Hong ,CA O Y u ,L U O S hi 2Y u ,W U Hang 2Ji ng ,L IU Fang ,CA O Yi ,Q IA O Dai 2Rong(College of Life Sciences ,Sichuan university ,Sichuan Public Platform of Bioinformaticsand Metabolic Engineering ,Chengdu 610064,China )Abstract :11strains of lactic acid bacteria were isolated and identified from six sorts of SiChuan pickles.These strains were all Gram positive bacterium and their results of catalase test showed negative.A acid high 2yield strain with rapid growth was selected from these 11strains ,designating as 070826221.On the basis of fermentation characteristics research on the strain as well as its morphology ,physiological and biochemical fea 2tures studied by Biolog system ,the strain was identified as Lactococcus lactis.Its optimum growth p H is 5～7,growth temperature is 30℃and the optimum growth salt concentration is 0～5%.K ey w ords :sichuan pickles ,lactic acid bacteria ,isolation and identification1　引　言泡菜作为一种传统的乳酸发酵蔬菜制品,由于其富含乳酸菌活菌,对提高人民健康水平、开发蔬菜加工品种、蔬菜原料的综合利用有着积极作用.乳酸菌发酵保藏蔬菜已经有很长的历史.我国是最早采用此法保藏蔬菜的国家之一.乳酸菌发酵蔬菜以其独特的风味和营养吸引着国内外众多的消费者.蔬菜中含有丰富的维生素、纤维素和矿物质,而乳酸菌发酵的”冷加工”方法对蔬菜营养成分和色泽的保持都极为有利[1,2].同时,泡菜中含有的乳酸菌进入消化道后,促进肠胃的蠕动,可以治疗便秘,还有降低血脂、增强机体免疫力的作用[3].因此将具有特定功能的益生菌用于蔬菜发酵,生产有保健功能的方便食品,既能提高蔬菜的附加值,又符合当代人们的健康诉求,使人们吃得既方便又健康.目前,国内泡菜主要集中在西南和中南各省[4],尤以四川成都泡菜为代表.四川泡菜以其酸2008年12月　第45卷第6期　四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition )　Dec.2008Vol.45　No.6鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性享有盛誉.由于成都位于川西平原腹地,温暖潮湿,四季分明的气候条件既有利于乳酸菌发酵,又有利于四季蔬菜常青,蔬菜资源极为丰富.本研究选择以四川地区自然发酵的泡菜汁为材料,旨在分离获得高产乳酸的优良乳酸菌菌株,并对其基本代谢特性进行研究,为进一步研制蔬菜发酵纯种乳酸菌剂奠定基础.2　材料和方法2.1　材　料2.1.1　供试材料　从成都、重庆采集到的自然发酵泡菜汁样品6份.2.1.2　培养基　MRS 培养基:酪蛋白胨10.0g ,牛肉膏10.0g ,酵母提取物5.0g ,葡萄糖20.0g ,乙酸钠5.0g ,柠檬酸二胺2.0g ,吐温801.0mL ,K 2HPO 42.0g ,MgSO 4・7H 2O 0.58g ,Mn 2SO 4H 2O 0.25g ,琼脂15.0g ,蒸馏水1.0L ,p H 6.2～6.4.2.2　实验方法2.2.1　自然发酵泡菜汁中乳酸菌的分离　自然发酵泡菜汁活化→10倍法稀释→涂布含有0.75%CaCO 3的MRS 平板→挑起有溶钙圈的单菌落染色、镜检→反复在培养基上划线纯化→单菌落菌株→甘油超低温保存.2.2.2　菌种筛选　在37℃固体划线培养,选出溶钙圈大、生长速度快的纯培养.液体培养选择产酸速度较快、产酸量大的菌株.2.2.3　初步鉴定　革兰氏染色和接触酶实验按文献[5]的方法.2.2.4　产乳酸定性试验　乳酸纸层析法展开剂　水∶正丁醇∶苯甲醇=1∶5∶5的量混合,然后加入1%的甲酸.显色剂　0.04%的溴酚蓝乙醇溶液,用0.1mol/LNaOH 调节p H 6.7.依据样品多少选择大小和使得滤纸,再纸张下方距边约3cm 处划条横线,每隔2.5～3cm 划一点作为点样位置,并注明点样编号.再点样的同时用2%的标准乳酸和不接培养液两个样品作为对照.将滤纸放入展开槽中,先用展开剂开始展开.一般上行25cm 即可,取出晾干喷显色剂,观察样品上行是否出现有黄色斑点,并与对照比较黄点位置已确定是否是乳酸.2.2.5　菌株鉴定　使用美国Biolog 公司的Biolog 全自动微生物鉴定仪,采用革兰氏染色阳性的细菌鉴定板进行鉴定.2.2.6　菌株生理特性研究　把对数生长期的菌液以1%的接种量接入液体培养基中,每隔2h 取样,用UV 22450分光光度计测定λ=600nm 吸光值,以空白培养基作为对照.测定生长曲线.可滴定酸(以乳酸计):把对数生长期的菌液以1%的接种量接入发酵培养基中,每隔2h 吸取1mL 发酵液,用9mL 无菌水中稀释,滴入1～2滴酚酞,用0.1mol/LNaOH 滴定.最后以吉尔涅尔度(°T )表示,中和100mL 牛乳所需的0.1mol/L NaOH 溶液的毫升数,若消耗0.1mol/L NaOH 溶液为1mL ,即为1°T.绘制产酸曲线.分别将MRS 液体培养基调到不同的p H 值,把培养到对数生长期的菌液以1%的接种量接种于其中,培养14h 后取样,以不同p H 的MRS 液体培养基作为对照,用UV 22450分光光度计测定在λ=600nm 吸光值.确实菌株生长的最佳p H 值.将菌株在不同的温度下培养,OD 值以同温下不接种的空白培养基作为对照,培养14h 后取样测定λ=600nm 处吸光值.确定菌株生长的最佳温度.将培养到对数生长期的菌液以1%的接种量分别接种于食盐添加质量分数为0%～10%的MRS 液体培养基中,培养14h 后取样,用UV 22450分光光度计在λ=600nm 处测定吸光值.测定菌株耐盐性.3　结果和分析3.1　自然发酵酸菜汁中优良菌株筛选结果对6种样品进行系列稀释后,在含有0.75%CaCO 3的MRS 培养基平板上进行涂布,选择有溶钙圈的菌落进行2～3次纯化分离,初步得到11株菌.经革兰氏染色镜检、接触酶反应发现这11株菌均为革兰氏染色阳性,接触酶试验阴性,初步认定这11株菌均为乳酸菌.再将其在相同培养条件下培养相同的时间,根据它们在平板上的生长速度和溶钙圈的大小,选择出1株生长速度快、溶钙圈大的菌株,其编号为070826221,对其进行生理特性研究.3.2　菌种鉴定3.2.1　形态学特点　菌落凸起,在培养基上多呈凸透镜状,菌落直径在1.0～2.0mm 左右,光滑、圆形、白色、边缘光滑,培养液中生长物混浊,兼151四川大学学报(自然科学版)第45卷性厌氧.菌体形态,经革兰氏染色后在油镜下观察菌体形态,菌体呈球状,直径0.8～1.0μm ,单个或短链排列(图1).图1　菌株070826221的光学显微镜观察(1000×)Fig.1　Shape of strain 070826221observedby optical microscope (1000×)3.2.2　纸层析乳酸定性结果　采用乳酸定性分析,通过纸层析法对乳酸标准溶液和070826221菌株发酵液进行对比试验,实验结果表明,070826221菌株发酵液中含有乳酸,说明此菌株为产乳酸菌株.3.2.3　Biolog 微生物鉴定仪鉴定结果　菌株070826221经Biolog 鉴定,结果与原鉴定结果完全一致,结果显示该菌株与标准菌株lactococcus lac 2tis 的相似性达到99%,具有很高的可信度.表1　菌株070826221的Biolog 鉴定结果Tab.1　BIOLO G Idendification of Strain 070826221菌株代号原鉴定结果Biolog 鉴定结果相似性070826221L actococcus lactis Lactococcus lactis0.993.3　菌株生理性能测定3.3.1　菌株的生长曲线　由图2可以看出,070826221的生长周期较短,生长速度快,培养4h后即进入对数生长期,培养10h 后即进入稳定期.3.3.2　菌株的产酸曲线　实验中分离到的乳酸菌070826221在以葡萄糖为碳源的培养基中没有产气现象,这一结果说明这株乳酸菌属于同型发酵乳酸菌,代谢产生的酸只以乳酸形式存在[6].由图3可以看出菌株070826221产乳酸速度快,并且产酸量大.发酵2h 后开始产酸,培养2～8h 乳酸在发酵液中快速积累,培养到24h 后乳酸含量基本稳定,最大可达到160°T.图2　菌液OD 值随培养时间变化曲线Fig.2　Growth curve of the strain 070826221图3　酸度随发酵时间变化曲线Fig.3　Curve of acidity of fermentation changed with time3.3.3　菌株生长的最佳p H 值　由图4不同p H值培养基接种菌株070826221的生长情况可以看出,菌株生长的最适p H 在5～7范围内.该株菌有很好的耐酸性,在p H3的环境中仍然可以生长.图4　不同p H 下菌体的生长情况Fig.4　The OD value of culture after 14hincubation at different p H3.3.4　菌株生长的最佳温度　由图5不同培养温度下菌株的生长情况可以看出,菌株的最适生长温度为30℃.1151第6期汪红等:四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究　图5　不同温度下菌体的生长情况Fig.5　The OD value of culture after 14h incubationat different temperature3.3.5　菌株的耐盐性　由图6可以看出,随着盐浓度的升高,菌株的生长受到抑制.菌株生长的最适盐浓度为0～5%,在6%时菌株仍能良好地生长,但盐浓度大于8%以后,菌株生长缓慢.图6　盐浓度对菌株070826221生长的影响Fig.6　The OD value of culture after 14h incubationat different salt concentration4　讨　论在四川泡菜的加工中,食盐的作用一是防腐,一般有害菌的耐盐力均较差;二是使蔬菜组织中水分析出,成品质地柔韧、咀嚼感强.盐浓度过高,乳酸菌的发酵受到抑制,泡菜的风味较差;如果盐浓度过低,杂菌容易繁殖,从而引起异味或变质.在泡制过程中,最好采取分批加盐,在发酵的同时,注意防腐,不仅可防皱皮使外观舒展饱满,缩短加工周期,而且可实现低盐化工艺,最后使盐浓度平衡在2～8%之间.从四川地区自然发酵泡菜汁中分离到1株生长速度快,产酸率高的乳酸菌,经Biolog 微生物鉴定仪鉴定该株菌属于乳球菌属,其最适生长温度为30℃,最适生长p H 为5～7.发酵2h 后开始产酸,培养2～8h 乳酸在发酵液中快速积累,培养到24h 后乳酸量基本稳定,最大可达到160°T ,而且该株菌可以在p H3的环境中生长.由于该菌生长速度快,在发酵初期就可以快速生长繁殖,加之其产酸速度快产酸量大,在发酵初期就可以在发酵液中积累大量的酸,降低发酵液的p H ,从而抑制其它杂菌的生长,而其自身又可以耐受很低的p H.另外该菌株具有较宽的盐适应范围,因此将该菌株用于泡菜的腌制可以缩短发酵时间、提高泡菜品质,具有开发利用的潜力.参考文献:[1]　陈仲翔,董英.泡菜工业化生产的研究进展[J ].食品科技,2004(4):33.[2]　张刚.乳酸细菌———基础、技术和应用[M ].化学工业出版社,2007.[3]　栾金水.乳酸菌的研究应用进展[J ].江苏调味副食品,2004,(1):8210.[4]　李金红.泡菜与乳酸菌[J ].中国调味品,2004,3:3.[5]　凌代文,东秀珠.乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法[M ].北京:中国轻工业出版社,1999.[6]　周德庆.微生物学教程[M ].北京:高等教育出版社,2002.[责任编辑:白林含]2151四川大学学报(自然科学版)第45卷。