放线菌分离培养基筛选及杂菌
杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验
杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验从海洋或淡水体的污泥中分离水生放线菌，以鳗弧菌和肠型点状气单孢菌，这两种典型病害菌为指示菌，筛选杀菌放线菌，并初步鉴定。
1.指示菌：鳗弧菌和肠型点状气单孢菌中科院水生生物研究所提供大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验室保存种2.放线菌株分离纯化：从不同地区海洋或淡水体的污泥样品，取3g加入30mL无菌去离子水中，震荡20-30min，梯度稀释至10-2、10-3、10-4 ，涂布于高氏1号平板（培养基中加入0.0075℅重铬酸钾，抑制细菌和真菌），28℃培养7d.挑不同形态的单菌落到高氏1号斜面培养，将菌落在平板上反复划线纯化得纯培养物，4℃冰箱保存。
分离出86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。
3.放线菌株的筛选：3.1初筛：将纯化菌株接种于改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养8d.用无菌钻孔器打成5mm的琼脂块。
取指示菌0.1ml涂布于普通琼脂平板，挑取打好的放线菌琼脂块反贴到已涂指示菌的平板上，鳗弧菌和肠型点状气单孢菌在28℃培养，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。
琼脂扩散法抑菌试验表明：19株淡水放线菌具有抑菌活性，32株海洋放线菌具有活性，故海洋放线菌产生抗菌物质比例高。
对初筛活性强的7株海洋和3株淡水放线菌加入复筛。
3.2复筛：有较强抗菌能力的放线菌接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃140r/min培养8d，取指示菌0.05ml涂布于普通琼脂平板，用无菌打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05ml注入孔中，培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。
获得较好的海洋放线菌4株，淡水放线菌2株，其抗菌活性测定结果表：六株放线菌抗菌活性测定结果（抑菌圈直径） mm鳗弧菌肠型点状大肠杆菌金黄色葡菌株产气单胞菌萄球菌1 18 17 15.5 19.52 18 18 16 183 15 15 16 184 10 8 -（无抗） 165 13 14 - 14.56 15 15 - 184.六株放线菌的初步鉴定：4.1形态和培养特征观察：分别接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 7 15 30d，取出插片，观察气生菌丝（包括颜色，是否产色素）基内菌丝（包括颜色，是否产色素）是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，取成熟期的特征作为分类依据。
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
细菌、酵母菌、放线菌的分离
三种菌生长所需营养、环境条件、生长因子不同，可用不同的培养基进行筛选细菌肉膏蛋白胨放线菌高氏1号酵母菌马丁加入青霉素可分离得到酵母菌，霉菌豆芽汁马丁培养基(用于真菌的检测)葡萄糖 1g蛋白胨 0.5gKH2PO4·3H2O 0.1gMgSO4·7H2O 0.05g0.1％孟加拉红溶液 0.33ml琼脂 1.5～2g蒸馏水 100ml自然pH2％去氧胆酸钠溶液 2ml（预先灭菌，临用前加入）链霉素溶液（10 000 u/ml） 0.33ml（临用前加入）改良马丁培养基蛋白胨 5g酵母浸出粉 2g葡萄糖 20g磷酸氢二钾 1.0g硫酸镁 0.5g蒸馏水 1000mlpH 值 6. 4 ± 0 . 2高氏1号(培养放线菌)可溶性淀粉 20gKNO3 1gK2HPO4 0.5gMgSO4·7H2O 0.5gNaCl 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g琼脂 20g蒸馏水 1000mlpH 7.4-7.6配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
察氏培养基(青霉、曲霉鉴定及保存菌种用。
)成分硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法加热溶解，分装后121℃灭菌20min。
克氏柠檬酸盐培养基成分柠檬酸钠 3g葡萄糖 0.2g酵母浸膏 0.5g单盐酸半胱氨酸 0.1g磷酸二氢钾 1g氯化钠 5g0.2%酚红溶液 6mL琼脂 15g蒸馏水 1000mL制法加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min。
放成斜面。
试验方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36±1℃培养7d，每天观察结果。
阳性者培养基变为红色。
豆芽汁液体培养基豆芽汁 1000mL磷酸氢二铵 1gKCl 0.2gMgSO4.7H2O 0.2g琼脂 20g6.4pH 6.2~制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH，分装于三角瓶中，0.04%的溴甲酚紫酒精溶液（黄色5.2-6.8紫色）作为指示剂，115℃灭菌20min。
放线菌的筛选
• 2.3菌株发酵滤液的拮抗性测定 选择初筛拮抗效果较好的放线菌进行液体发酵培养， 利用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定菌株 • 发酵滤液对不同病原菌的拮抗作用。 （1）发酵滤液的制备 将孢子浓度为108个/mL的放线菌接种到液体发酵培 养基中，于28℃，200 rpm/min摇床中恒温培养，5 d 后取发酵液于4500 rpm/min条件下离8min，上清液经 微孔滤膜过滤，得发酵滤液。 （2）抑制菌丝生长速率法测定滤液的拮抗作用 取1mL发酵滤液与9mL融化的PDA培养基充分混匀， 倒入无菌培养皿中制成带药平板。待培养基凝固后， 在板中央接入一直径为7 mm的病原菌菌饼（带有菌丝 的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加 1mL蒸馏水的PDA平板为对照。培养5d后，十字交叉 法测量供试病原菌菌落直径，通过下述公式计算抑制 率
• 1.4 主要仪器 BCD-265冰箱 FA2004N电子天平 pH S-3C酸度计 TGL-16G型高速台式离心机 YXQ-L31-400蒸汽灭菌锅 GRP-9050隔水式恒温培养箱 DL-CJ-2N高性能无菌实验台 HZQ-Q全温振荡器 QL-901旋涡混合器
• 2.方法 • 2.1土壤中放线菌的分离、纯化 • （1）土样的预处理 将采集到的土样自然风干，按1：10的比 例加入碳酸钙，28℃培养箱内放置5-7d。 • （2）土壤悬浮液的制备 研钵研磨预处理的土壤样品至颗粒均匀。 称取1g土样加入装有l0mL无菌水的试管中， 充分震荡10min，制成浓度为10-1的土壤稀 释液。吸取1mL上清液，加到装有9mL无菌 水的试管中震荡成10-2的稀释液。依照同种 方法制备浓度分别为10-3、10-4、10-5的土 壤稀释液。
• （3）管碟法测定滤液的拮抗作用 培养好的病原菌制成一定浓度的菌悬 液，与适量PDA培养基充分混匀，倒入 无菌培养皿内制成带菌平板。待培养基 凝固后，在板的中央放置1个牛津杯，加 入0.2mL发酵滤液，每个处理重复3次。 以加蒸馏水的PDA平板为对照。置28℃ 恒温箱中培养，5 d后利用十字交叉法测 量抑菌圈直径。 结合初筛及发酵滤液对病原菌的拮 抗试验，确定目的菌株。
四类微生物的分离、培养及鉴定
四类微生物的分离、培养及鉴定环境与生物工程学院环科0701班摘要：本实验介绍了细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法，并阐述了其分离和培养过程。
观察和比较分离出来的细菌以及放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，通过染色法对各类细菌进行鉴定。
将从土壤中分离出的几种不同微生物，分别接种于不同培养基上，于35 ℃培养24 h、48 h后，观察记录其生长情况。
该研究对混合感染时不同培养基的组合与使用，病原微生物的准确分离与鉴定，以及临床细菌日常检验工作均有一定的指导意义。
关键词：微生物，菌落，分离，培养，鉴定Abstract：This experiment is introduced, mould, bacteria, actinomyces commonly preparation methods of medium yeast, and expounds its separation and training process.Observe and compare the isolated bacteria and actinomyces, yeast and mould colony feature, dyeing method for all kinds of bacteria by identification.Isolated from the soil microorganisms, several different respectively in different media, vaccinations in 35 ° c h, 48 h training and observed after its growth record.The study of mixed infection with the combination of different media, pathogenic microorganisms accurate and separating, and clinical bacteria daily inspection work has certain directive significance.Keywords:Microbes, Bacteria, Isolation, Culture, Identification引言为了深入了解常用选择性培养基对不同微生物的抑制或筛选能力，为了充分利用各培养基的特殊作用，从而给院内感染监测及临床微生物检验工作者选择利用各培养基及其组合时提供有益参考，我们把从土壤中分离出的几种微生物分别接种于常用培养基上，对比研究了它们的不同生长特点。
放线菌的选择分离培养
3,培养
平板倒置于 28℃培养箱中培养7天,观察菌落的生长情况,菌落特征.
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1 ,取样
三 ,操作步骤
2, 制备土壤稀释液
3, 倾注平板
4,培养
四,实验操作内容
每组所需材料:
土样,装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶1瓶,9ml无菌水两支, 1或2ml移 液管2支,2副培养皿,60ml高氏1号培养基1瓶.
实验步骤
1,制备土壤稀释液 取土样0.5g,土样热处理后,加入装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中, 室温下手摇振荡10分钟,静止5分钟,用移液管取上清液1ml(10-2)加入到9ml 无菌水稀释到10-3,同样操作稀释到10-4.注意回收玻璃珠. 用移液管分别吸取10-2原液和10-4稀释液各0.5ml于标志稀释倍数的平板上 ( 10-2原液1个平行, 10-4稀释液1个平行).
二,平板分离法
A 平板划线分离法 B 倾注平板法 C 稀释涂布平板法
1)放线菌分离常用基础培养基 2)选择性培养基
选择培养基的设计
如:高氏一号琼脂;精氨酸-甘油琼脂;葡萄糖-天冬酰胺琼脂.
a,为抑制细菌及霉菌的生长,可加入链霉素(抑制细菌)和制霉素等. b,加入重铬酸钾可同时抑制细菌和霉菌的生长;对放线菌生长无抑制作用 .
文化素质教育课程
"生命科学导论"实验
放线菌的选择分离培养
一,放线菌的选择分离培养
1 ,目的要求
从土壤中分离纯化放线菌,初步掌握微生物的土壤中放线菌最丰富,品种齐全.从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣 中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和 嗜酸性的菌种. 土壤中含有丰富的放线菌,主要是链霉菌.而链霉菌以外的其他放线 菌,如小单孢菌,游动放线菌,诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要 的产生菌.但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法 很难得到. 对样品进行风干,干热处理,培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真 菌的数量;用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法,可以分离得到更 多种类的放线菌.
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
分离放线菌实验报告
分离放线菌实验报告分离放线菌实验报告一、引言放线菌是一类广泛存在于土壤和水环境中的细菌，具有丰富的代谢能力和生物活性物质产生能力。
为了研究放线菌的多样性和潜在应用价值，本实验旨在从土壤样品中分离放线菌，并对其进行鉴定和初步评估。
二、材料与方法1. 样品采集：从不同地点的土壤中采集样品，保持样品的新鲜度和原生态。
2. 样品处理：将采集到的土壤样品进行稀释，以获得适合分离放线菌的浓度。
3. 分离放线菌：将样品分别涂布在含有富集放线菌所需营养物质的培养基上，然后进行孵育。
4. 鉴定放线菌：观察培养基上出现的菌落形态和颜色等特征，选取具有代表性的菌落进行进一步鉴定。
5. 鉴定方法：通过显微镜观察菌落形态和细胞形态，对菌株进行初步分类。
使用生化试剂和生理特性测试进一步鉴定放线菌的代谢能力和特性。
三、结果与讨论经过培养和鉴定，我们成功地从土壤样品中分离出多个放线菌菌株。
根据菌落形态和细胞形态的观察，我们初步将这些菌株归类为链霉菌属、链霉菌属和新链霉菌属等。
进一步的鉴定工作表明，这些放线菌菌株具有多样的代谢能力和特性。
其中一些菌株显示出产生抗生素的能力，这对于开发新的抗菌药物具有潜在意义。
另外，一些菌株还表现出对重金属离子的耐受性，这可能与其在环境修复中的应用有关。
通过对放线菌菌株的形态特征和生理特性的研究，我们初步了解了这些菌株的生物学特性。
然而，进一步的分子生物学和基因组学研究将有助于更全面地揭示这些放线菌的潜力和应用价值。
四、结论本实验成功地从土壤样品中分离出多个放线菌菌株，并对其进行了初步鉴定和评估。
这些放线菌菌株具有多样的代谢能力和特性，包括抗生素产生和重金属耐受性等。
这些发现为放线菌的应用研究提供了基础，并为开发新的生物技术和药物提供了潜在的资源。
然而，本实验只是一个初步的探索，还需要进一步的研究来深入了解放线菌的多样性和潜力。
相信通过不断的努力和研究，我们能够更好地利用这些放线菌资源，为人类的健康和环境保护做出更大的贡献。
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结果与分析
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参考文献
1. 培养基制备: 分别按A, B, C, D, E, F, G, H 8 种培 养基成分称量, 配制好后1 × 105Pa 30min 灭菌, 冷 却至50 ℃ ~ 60 ℃ 按不同处理加入抑制剂倒平板备 用。
2 .土样中放线菌分离: 稀释平板涂抹法分离, 28 ℃ 培养7d。
结 培养基种类对放线菌分离计数结果的影响 果 与 分
研究目的
放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物。目前从微生物中 发现的 8, 000多种微生物活性物质中, 有近70% 是放线菌产生的 。但是, 放线菌仅占土壤中所有放线菌的10% 左右 。开展大规模放线菌资源调查 和建立有效 的放线菌分离方法是发现放线菌新种属和新活性物质产生菌 的重要途径之一。现有的 放线菌分离培养基多达30 余种 , 放线菌资源调 查待分离土样数量很大, 培养基种类 过多将加大分离工作量, 故筛选几种 出菌率高、能将土壤中绝大多数种类放线菌分离培养出的代表性培养基, 可在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下, 有效减少工作量。
虽然少数寄生性的放线菌会引起人和动植物病害，有些放线 菌会使食物变质，或者对棉毛织品和纸张造成破坏，对人类有害， 但这些比起放线菌的功绩来，实在是微不足道的。
材料
1 .土壤样品: 采自青海省不同肥力的农田土
壤, 1、.培养基
A 高氏1 号琼脂培养基 B 黄豆粉琼脂培养基 C 秸秆腐解物琼脂培养基 D 泥炭浸汁琼脂培养基 E 土壤浸汁琼脂培养基 F 燕麦片琼脂培养基 G 腐殖酸琼脂培养基 H 小麦粉琼脂培养基
放线菌最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中，泥土所特
有的“泥腥味”就是由放线菌产生的。它们中绝大多数是腐生菌， 能将动植物的尸体腐烂、“吃”光，然后转化成有利于植物生长 的营养物质，在自然界物质循环中立下了不朽的功勋。还有一类 叫弗兰克氏菌的放线菌，生长在许多豆科植物的根瘤里，能固定 大气中的氮，成为植物能利用的氮肥。除了生产抗生素外，放线 菌在工业上还有许多其他贡献。例如，利用放线菌还可以生产维 生素B12、－胡萝卜素等维生素，生产蛋白酶、溶菌酶，以及用 于生产高果糖浆的葡萄糖异构酶等酶制剂。另外，放线菌在石油 工业和污水处理等方面也可发挥一技之长。