一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用
棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 958−964/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111303); 教育部新世纪优秀人才项目(NCET-04-0500); 教育部111引智计划(B08025)作者简介: 佘义斌(1981−), 男, 江苏人, 硕士, 从事作物遗传育种研究; 朱一超(1980−), 男, 江苏人, 在读博士, 从事棉花遗传学研究。
** 同等贡献。
*通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍。
E-mail: moelab@Received(收稿日期): 2007-08-15; Accepted(接受日期): 2008-01-15.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00958棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA 的克隆、表达及染色体定位佘义斌** 朱一超** 张天真 郭旺珍*(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095)摘 要: 腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。
通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA 文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA 序列。
该cDNA 序列长1 598 bp, 利用5′RACE 技术得到上游318 bp 的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp 的cDNA 序列, ORF 为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点p I ＝5.69, 分子量MW ＝53.2 kD 。
该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。
根据Southern 杂交结果推测GhSAHH 基因在陆地棉基因组中为单拷贝。
不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用
不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新【摘要】新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V 蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2013(035)009【总页数】5页(P702-706)【关键词】新城疫病毒;V蛋白;蛋白表达;多克隆抗体;细胞嗜性【作者】傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起的一种高度接触性传染病，给养禽业造成了严重损失[1]。
单克隆及多克隆抗体制备
单克隆抗体制备
七、抗体纯化
• 硫酸铵沉淀法：简易价廉、浓度高，但纯度不高 • 辛酸沉淀法：纯化IgG类抗体，价廉，但纯度不高 • DEAE柱层析法：起始抗体PH只高于抗体等电点，抗体与 DEAE结合，用离子强度逐渐增强的缓冲液洗脱。 • 蛋白A、蛋白G柱纯化抗体免疫亲和层析：从多克隆血清 中纯化特异性抗体方法
• 免疫亲和层析法：
（1）用抗原免疫亲和柱纯化：对多克隆血清，纯化特异性
抗体唯一方法 （2）用抗Ig免疫亲和柱纯化抗体：分离大鼠单克隆抗体
八、抗体的保存
• 血清、组织或培养上清、腹水保存：0.02%NaN3;分装保 存
• 纯化抗体保存：PH值调整，PBS或其他等渗溶液，浓度 不宜过低，如果不用于标记可在低浓度抗体中加1%BSA 以提高蛋白浓度，加NaN3;分装冻存。
抗体制备
多克隆抗体制备 一、免疫动物
• 动物选择：种类多。哺乳类或禽类。选择适龄、健壮的动
物
• 原则：需要血清量、抗原从何种种属动物分离获得，需要 单抗时，有多少抗原可使用。 • 常用种类：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中国仓鼠 • 商品用动物：猪、马、牛、羊 • 多抗制备常用兔（得到500ml血清！）
动物选择
• 小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.51mg/次 • 加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5 • 高度特异性抗血清：策略为低剂量抗原短程免疫法 • 高效价的抗血清：策略为大剂量抗原长程免疫法。
三、佐剂的应用
• 颗粒性抗原或全细胞抗原不需要佐剂 • 可溶性抗原须用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫 反应的类型，刺激机体产生较强的免疫应答 • 佐剂种类：弗氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂、氢氧化 铝佐剂，SAF-1和RAS • IFA：羊毛脂1份，石蜡油5份，每毫升IFA中加入1-20mg 卡介苗即为CFA。
抗体的制备与应用
优点: 克服了HAMAR的问题 分子量小、渗透性高，靶向性增加 ScFv可保留较高活性
类型
（1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv） （2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）
1.dsFv（二硫键稳定的单链抗体）
利用基因突变技术在VH和VL上加入 半胱氨酸，利用两者形成的二硫键 将VH和VL连接在一起。
杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ , 能生长, 且 能永生化）
4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
筛选： 免疫荧光 ELISA等
克隆化： 有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法
5.杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案: 杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液， 10%DMSO ) “慢冻”: 分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”: 取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
• 激活补体 Immune complex（IC） 激活补体经典途径
• 与细胞表面FcR结合 1）调理作用（opsonization)；
IgG 或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；
2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 （Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)
3.杂交瘤细胞的筛选
采用筛选培养基: HAT培养基 H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶
只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培 养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功 合成DNA。
DNA合成途径
内源性途径（主要途径） 利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还
原酶的催化下合成DNA (氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 因此能有效阻
Caspase半胱氨酸蛋白酶家族蛋白介绍
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Caspase-6(CT)半胱氨酸蛋白酶蛋白-6（C端）
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
◆Caspase-6（NT）与Caspase-3有38%的同源性，属胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族。在凋亡执行阶段起中心作用，可被Caspase-7、-8、-10剪贴。它是唯一一个可以剪贴核纤维层蛋白的Caspase.分子量为：34KDa。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
CD4（Mouse Anti-Human CD4 Monoclonal Antibody）
S-0551M
◆小鼠抗人CD4单克隆抗体
◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600 ICM=ICM=1:100-200
◆小鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody）经亲和纯化，溶于PBS（pH7.4）中，含BSA等稳定剂，识别17-19KDε链，可与人CD3抗原的ε链和T细胞抗原受体(CD3/TCR)复合体反应。类别：IgG2a,κ。CD3抗原在60-80%正常人外周血淋巴细胞和60-70%的人胸腺细胞上表达。在T细胞发育的早期，CD3抗原主要在胞浆中表达，晚期出现在膜上。在抗原识别中，CD3抗原起着信号传递的重要作用。有报道，CD3抗原在NK细胞的胞浆中(非膜上)表达，为研究T细胞和NK细胞的发育关系和共同的前体细胞提供了一种手段。抗CD3抗体在微量时对T细胞有强的致分裂原效应(在可溶性或固相条件下)，大剂量时有免疫抑制作用。
西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析
西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析阳永学;程维舜;曾红霞;张娜;施先锋;孙玉宏【摘要】[目的]克隆西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1,并对其进行生物信息学分析.[方法]以西瓜花蕾cDNA为模板,借助西瓜全基因组数据库,采用RT-PCR方法对西瓜半胱氨酸蛋白酶基因进行克隆并进行生物信息学分析.[结果]克隆得到一个开放阅读框长度为960bp的序列,命名为ClCP1.该基因编码319个氨基酸.ClCP1基因的保守结构域分析结果表明,ClCP1属于木瓜蛋白酶家族基因,与已知其他植物半胱氨酸蛋白酶在氨基酸序列上有56％～ 85％的相似性.聚类分析结果显示,ClCP1与同为葫芦科的黄瓜CP基因亲缘关系较近.[结论] ClCP1属于西瓜木瓜蛋白酶家族新基因,为进一步研究西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1的表达和功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)028【总页数】4页(P11286-11288,11319)【关键词】西瓜;ClCP1;基因克隆;生物信息学【作者】阳永学;程维舜;曾红霞;张娜;施先锋;孙玉宏【作者单位】武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345【正文语种】中文【中图分类】S651半胱氨酸蛋白酶(CPs)作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的许多生理过程，如种子贮存蛋白的分解，对逆境的反应及参与植物细胞程序化死亡［1］。
近些年来，植物中发现的半胱氨酸蛋白酶主要有papain(木瓜蛋白酶)(C1)家族、天冬氨酸蛋白内切酶)(C13)家族、caspase(天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶)(C14)和calpain(钙依赖半胱氨酸蛋白酶)(C2)家族，其中papain家族(C1A)研究得最为详尽。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用[发明专利]
![一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/afef0d2ec381e53a580216fc700abb68a982ada3.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011279339.1(22)申请日 2020.11.16(71)申请人 扬州大学地址 225000 江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人 郑英 徐文华 葛婷婷 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人 王艳(51)Int.Cl.C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C07K 14/47(2006.01)C07K 16/18(2006.01)C07K 16/06(2006.01)G01N 33/68(2006.01)A61K 39/395(2006.01)A61P 15/08(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种重组表达载体、重组菌、Tulp2原核蛋白及其制备方法，本发明还公开了一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用。
本发明还公开了Tulp2原核蛋白、Tulp2蛋白多克隆抗体在制备诊断或治疗男性不育症试剂或药物中的应用。
该Tulp2多克隆抗体能特异性识别小鼠及人组织中的Tulp2蛋白，可应用于小鼠及人多种组织ELISA、Western Blot、组织免疫荧光等技术分析，具有特异性高，适用广泛等特点。
权利要求书1页 说明书7页序列表4页 附图6页CN 112553233 A 2021.03.26C N 112553233A1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达质粒是将Tulp2基因插入到原核表达载体中得到重组表达载体。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为大肠杆菌表达载体。
3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求1或2所述的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到重组菌。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
D7E3456789 " 52>*J=1J+LH*J=1C>J!M2>N# q/rsY?789Gt!uvwm12:x-]yz(
{|}~12 M2>N?! ^y OP@NMOnoZ|/0 M2>N?K" 012
34/5# +AQRSPT@P( UJLH>!;<> +VAW@&N#!g{ +VAW@
89:$ #";%<&< ,0.=>>1.#""?@#(!?;!"#$;"&;"#
-./0123456789:;<=>?@ABC
!""# #7$! %&'#!()*!!
"#.!"]ef% -gJ%%h!!" ij %#""#$)!.!"k#$J%h \lm-2noVWp!!" ij %#""!##
!"#$%& !"#$ !%&'"()#(&$*+,*-'$.%*./'/! !"#$!%""&# $ $$# '$$(
)**+$ ,,---./01234.51
'((!)*!+,-!../0123456789:;<=>?@ABCDE% 6& .!"#$%&!!"#$!%" "&# $
$$# '$$(.7
X4M2>N) C¡¢f£¤¥¦ YZ!#+D2>R §¡)s¨? X4M2>N©ª78«y¬®~¯°!±²
³´@A:;<=>![J>*JL1 µ¶}~·¸!¹=>ºs¨ X4M2>N78»-¼½?±²%¾D¿ÀÁÂ
/!Ãp? M2>N=>ÄÅÆÇ?È( ÉÊËÌ{Í/ÎÏÐ12 M2>N?ѺÒÐ|KÓ(
+$$!+
!"#$%&7Á %" Ë7Á & Ì
æç%?& *èé%(& êë%(& .12;<ì:x3 456789K( íî3456789f: ïð +C+C=1" dñ789# !Cò°óô>XYõ 3456" M2># *¨56" ]=># *ö÷56øö÷ ùú" Q>+ ,Q>1# ¨û!üýþÿ!?"# $%{ M2>@]=>@Q>1 ,Q>+%&& ( &SVW·¸!34 56789'(wm)*Ö78?æ+`E%E& * ,-./.yz%$& !0¿þ12m\1`yz »2sY`E( R)=1`H.%<& »3áOâ?/ 0 M2>N45>67¦ G7#&4#'/"'.*&*$ 8{9:) bC>5)C1=.%#"& ;E c:VR no<=345678 9 M#? K!ËÌ¡>1?6@¦ 5,4#7K,#,7&$ '.8*/#$./8{:\( AB!CDE345678 9 L3L% K?45'(FG|Kð 38@! H¡ ?7¦=!C45>1?I6@¦ 56'.8*/2 #$./8{9:%## '#%& ( JK! M2>NL M N û { 7 ¦*O ¦* \ l . : x \ 2 ? P Q! R S! ä å TUVWV\l" ;7H$#74*))7M)*$8"(&)%*H'.'2 ='&(/! PSZMc# ?<=X@´ c! m345678 9 MSN# 1`X@C789Y%#?& )O¦ L6 /7)$.$"*$&(H 7 8 NH+N! m 3 4 5 6 7 8 9 O8#< 1`ZCÐ[ðO\!Z0]^CH ¡?=\Y%#(& (
773456789 " 52>*J=1J+LH*J=1C>J!M2>N# q/rÔÕ-2>Ö78×ØÙÚ?sY78
9Gt!uvwm-2>?:ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ-]yz( ÛÜ Ý!VWSÞßàZáOâ%#& *ã%!& *äå%%& *
!"#$!"#$@"%@!$ %&'(FGHIJ%KL"%#("#&"# )*+,'(("#<<!'# !M!NOPQRS!TUVW-!XYZ[12\]%VW( A@BC=D$ #%<<E&E%#$FGG.5HB !^_`a!+,-!A@BC=D$ G>)D=CHFCD=2I1.5HB) bcd!A@BC=D$ /))J1KBIF*>=1K)IC.HLK.51
FGH3456789)):;<=>
IJKLM\E$
NOPQRQ
NSTM#""?@#(!?"!"#$#"&@"$$#@"(
!"#$%"%&'()%)*%$$+',%&'()(-./+&',+()%+%)&'0(*1 %2%')3&$+%)&,13&#')#$"(&#')%3#
NAXV\=G=# ! SQXV6=C1! ! Z:Q9\=C1>)J1K#!! ! U]QXV]J1KBI!!! "#637))*%*789'8*:"'*."*/! +,*-'$.% :"'2;*", <.'=*&/'#4! >$.%?,7( @ABBAC! 3,'.$) !6D./#'#(#*78E'&7)7%4$.F G'7#*",.7)7%4! +,*-'$.% !"$F*H478!%&'"()#(&$):"'*."*/! >$.%?,7( @ABBIA! 3,'.$# 403&"%,&$ M2>*J=1J+LH*JC>J>" M2>N># CLJC^CB=D2H^=B+HL*C1*+LH*JC>J>*)C*CLJ=1_HD_J` =1 C-=`JLC1KJH^+DC1* +)2>=HDHK=5CD+LH5J>>J>.PH5)CLC5*JL=/J>I5) +LH*J=1C>J! CKJ1JJ15H`=1KM2>N-C>CB+D=^=J` 42OP@NMO^LHB0'"2 7#'$.$ 1*.#,$H'$.$ +DC1*>C1` D=KC*J` =1*H+AQRSPT@P( UJLH_J5*HL.P)J=1>JL*=H1 -C>>JGIJ15J` C1` *)J1 >I4@ 5DH1J` =1*H*)J+LHaCL2H*=5J3+LJ>>=H1 +DC>B=` +VAW@&N#! 1CBJ` C>+VAW@X4M2>N.P)J+DC>B=` -C>*LC1>^HLBJ` =1*HJ/",*&'",'$ "7)'YZ!#+D2>R ^HL=1`I5=4DJJ3+LJ>>=H1.P)JLJ5HB4=1C1*X4M2>N^I>=H1 +LH*J=1 -C>+IL=^=J` -=*) C^^=1=*25)LHBC*HKLC+)2C1` I>J` ^HL+LH`I5=1K+HD25DH1CDC1*=4H`242=BBI1=/=1KLC44=*>.:1 =BBI1H4DH**=1KC>>C2>! *)J+HD25DH1CDC1*=4H`25HID` LJC5*>*LH1KD2-=*) *)JLJ5HB4=1C1*X4M2>N+LH*J=1 C>*)J+LJ>J15JH^C>=1KDJ4C1`! =1`=5C*=1K*)C**)JC1*=4H`2-C>>+J5=^=5CKC=1>**)J+LH*J=1C>J.P)J>JLJ>ID*>DC=` C^HI1`C*=H1 ^HL^IL*)JL5)CLC5*JL@ =/C*=H1 H^=*>^I15*=H1. 5#1 6("*3$ 52>*J=1J+LH*J=1C>J) +LHaCL2H*=5J3+LJ>>=H1) BID*=5DH1CDC1*=4H`=J>