绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备_马小渊
兔抗Myosin Ⅹ多克隆抗体的制备及初步应用
兔抗Myosin Ⅹ多克隆抗体的制备及初步应用张建华;施恒亮;翟艳华;俞华莉;曹让娟;朱筱娟【期刊名称】《东北师大学报：自然科学版》【年(卷),期】2012(44)1【摘要】为制备兔抗肌球蛋白Ⅹ(myosinⅩ,MyoⅩ)多克隆抗体,合成了含有MyoⅩN端1 000～1 021个氨基酸的多肽,将纯化后的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin,KLH)进行交联;通过背部皮下免疫新西兰大白兔获得免疫血清,并通过ELISA、免疫印迹、免疫荧光等分析对免疫血清进行了初步的验证.结果表明:经过4次免疫后可获得免疫血清,ELISA检测表明抗体终效价达到1∶51 200,抗原吸附实验进一步证明了此多克隆抗体的特异性.利用获得的多克隆抗体检测了多种组织中MyoⅩ的表达,发现兔抗MyoⅩ多克隆抗体可特异性识别多种组织中的MyoⅩ.免疫荧光染色表明该抗体可以显示MyoⅩ在COS-7细胞、NLT细胞和神经元中的分布.【总页数】5页(P140-144)【关键词】肌球蛋白Ⅹ;多克隆抗体;半抗原【作者】张建华;施恒亮;翟艳华;俞华莉;曹让娟;朱筱娟【作者单位】东北师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用 [J], 刘少伟;姜欢;王晓龙;李梦红;陈玉;唐中元;胡敏2.兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用 [J], 成毅明;刘美玲;石心泉;王介东;贾孟春3.兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定 [J], 杨秉芬;李平;李娟;瞿秀华;李晓明;柳晓兰;孙启鸿;曹诚4.兔抗长爪沙鼠免疫球蛋白G特异性多克隆抗体的制备与应用 [J], 姜慧芬; 陈卓; 徐笑红; 吴宇辰; 郑晓妍; 蔡静; 高孟; 罗永能5.兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化 [J], 何萍;张斯;尹元琴;隋承光;孟凡东;王晓华;张志强;姜又红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。
（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。
(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。
用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。
(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。
初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。
(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。
使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。
每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。
9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。
(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。
用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。
用PBS-Tween洗6次。
(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。
绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定
绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【摘要】绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×104和5.2×104的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.%GFP is one of the most popular fluorescent proteins used to detect and quantify targeted proteins in living organ-isms.To develop a high sensitive antibody for its detection or signal capture in di fferent kind of organisms,6×His-tagged and GST-tagged prokaryotic expression plasmids,pET28A-gfp and pGEX-2T-gfp,were constructed,by insertinggfpinto the pGEX-2T and pET28A vectors respectively and then were transformed intoEscherichia coli BL21(DE3)for protein expres-sion. 12% SDS-PAGE analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein 6×His-GFP and GST-GFP were2.6×104 and 5.2×104,respectively.The 6×His-GFP fusion protein was purified by affinity adsorption purification to immunize New Zealand white rabbits.The 5th immune serum was collected and the antibody titer was determined to be 1﹕32,000 by ELISA.The antiserum was purified by Protein A affinity adsorption purification and immobilized GST-GFP puri-fication,and the specificity of polyclonal antibodies was evaluated by Western blot in three kind of organisms including chlamydomonas,HEK293 cells and bacteria.Results show that the polyclonal antibody prepared can specifically and pre-cisely bind GFP in all kind of organisms,which can be used for more GFP and GFP related research.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2017(032)002【总页数】6页(P7-12)【关键词】原核表达;蛋白纯化;多克隆抗体;免疫印迹【作者】董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【作者单位】食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津 300457【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)于1974年由 Morise等[1]在水母中发现并分离出来．该蛋白包含238个氨基酸，第 65～67位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成荧光发色基团为对羟基本咪唑啉酮[2].直到 1994年，Chalfie[3]首次将绿色荧光蛋白应用在活体当中，在原核细胞大肠杆菌(Escherichia coli)和真核细胞秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中表达成功，可以通过观察绿色荧光的方法对该蛋白在活体内进行定位．随后通过对GFP的DNA序列进行分析，并对其中一些氨基酸进行替换和突变，证实突变可以导致产生红色荧光的蛋白(red fluorescent protein，RFP)[4]和黄色荧光的蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)[5]．突变蛋白如红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等已经被广泛应用于活体细胞定位、内源蛋白检测以及单分子成像[6]等方面．GFP相对分子质量约为2.6×104，易于与其他蛋白融合表达，对受体细胞无毒副作用，且对其检测方式多样，如可以直接在荧光显微镜中观察其在活体中的定位和定量[7]，亦可进行免疫印迹实验(Western blot)对其进行检测和定量．然而，利用 GFP对相应内源蛋白进行活体定量时，由于活体细胞本身的一些自荧光物质的存在，会对实验结果产生较大影响[8–9]，因而不能对荧光信号进行准确定量．此外，组织或细胞在各种理化处理过程中，GFP易被猝灭，不利于对组织中 GFP标记蛋白进行细胞内定位及所在组织的结构和功能的原位分析[10]．因此，如果有一种对 GFP高灵敏度和高特异性的抗体存在，就可以通过利用免疫印迹方法对 GFP 及其标记蛋白进行定量．目前，抗 GFP蛋白抗体的研究已有很多，存在的问题是大多数多克隆抗体或单克隆抗体仅能对在一种或少数几种细胞内表达的 GFP蛋白进行特异性识别，而对于其他种属细胞内表达的 GFP并不能进行很好的专一性识别，主要原因是细胞背景干扰过高．对于如今科学研究的需要，如果一种抗体可以广泛地应用于检测多种种属细胞，可以显著提高效率，降低成本．目前，能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体还未见报道，而多克隆抗体成本低廉，生产快速的特点引人注目．因此，制备能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体势在必行，本实验室采用简单和经济的原核表达方法制备了高特异性的 GFP抗体，并运用多种方法对抗体纯化以提高抗体特异性．此外，利用 Western blot在多种属细胞中检测了抗体的特异性，从而为 GFP 作为一种标记蛋白使用提供了一种更为经济有效的检测抗体．1.1 菌株、质粒及实验动物大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-blue、BL21 (DE3)感受态细胞、HEK293细胞、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-125野生藻株和质粒pBSK-gfp、pGEX2T、pET28A均为本实验室保存．新西兰雄性大白兔 2只，1.5～2.0,kg，由天津欧阳实验种兔场提供．1.2 主要试剂蛋白Marker、限制性核酸内切酶、DNA连接酶，美国Thermo公司；DNA marker，北京全式金生物技术有限公司；蛋白纯化用填料 Ni SepharoseTM6,Fast Flow和Glutathione SepharoseTM4B以及抗体纯化介质Protein A SepharoseTMCL-4B，美国GE Healthcare公司；免疫动物用弗式完全佐剂和不完全佐剂，美国Sigma公司；NC膜，美国PALL公司；HRP标记的羊抗兔抗体，美国Jackson Immuno Research公司；ECL显色液，美国Millipore公司；脱脂奶粉，美国 BD公司；曝光底片，美国柯达公司；其他试剂均为国产分析纯．1.3 pGEX-2T-gfp 和 pET28-gfp 原核表达载体的构建以 pBSK-gfp质粒为模板，用上游引物5′-GCGGATCCATGGCCAAGGGCGAGGA-3′(加BamHⅠ酶切位点)、下游引物5′-CTAAGCTTTTACTT GTACAGCTCGTCCA-3′(加HindⅢ酶切位点)进行gfp基因扩增，反应条件为：95,℃ 1,min；95,℃ 30,s、55,℃ 30,s、72,℃ 2,min，30个循环；72,℃ 10,min．取2,μL PCR产物进行0.8%,的琼脂糖凝胶电泳分析．然后再用BamHⅠ和HindⅢ回收的目的基因、pGEX-2T和pET28A载体进行双酶切，然后将带有黏性末端的目的基因和载体用 T4 DNA连接酶连接后，转化入E．coliXL1-blue感受态细胞，挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，酶切和测序验证．1.4 融合蛋白的表达与纯化1.4.1 6×His-GFP和 GST-GFP融合蛋白的诱导表达及鉴定将正确的重组质粒pET28-gfp和pGEX2T-gfp转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，分别挑取单菌落于含有100,µg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中和含有120,µg/mL氨苄青霉素 LB液体培养基中过夜培养，再以1﹕20的比例放大培养至吸光度为0.6～0.8时，加入0.2,mmol/L IPTG于23,℃诱导6,h使蛋白大量表达，同时设置对照组即不加 IPTG诱导组．离心收集菌体并超声裂解获得全蛋白，全蛋白经4,℃、12,000,r/min离心 15,min后，收集上清液和沉淀．取全蛋白、上清液和沉淀分别与2×蛋白上样缓冲液混合后进行12%, SDS-PAGE电泳检测．1.4.2 6×His-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后，加入到预先平衡好的 Ni Sepharose 6,Fast Flow纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，5,mmol/L咪唑，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，500,mmol/L 咪唑，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白，使用核酸微量测定仪对其进行蛋白浓度测定．将洗脱出的目的蛋白进行12%,的SDS-PAGE分析[11]．1.4.3 GST-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后加入到预先平衡好的Glutathione SepharoseTM4B纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，10,mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白．将目的蛋白进一步通过分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化，流量 1,mL/min，将洗脱出的目的蛋白进行12%, SDS-PAGE分析．1.5 多克隆抗体的制备及效价的测定1.5.1 多克隆抗体的制备取2,mg纯化后的6×His-GFP融合蛋白与2,mL弗氏佐剂混合后乳化完全，免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点注射法，初次免疫使用弗氏完全佐剂且免疫前耳动脉采血作为阴性对照血清．之后每 10,d进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，一共加强免疫 4次，最后 1次加强免疫后耳动脉采血，利用间接ELISA法测定抗血清的效价，效价合格后，股动脉采血，4,℃静置过夜后收集血清，分装冻存．1.5.2 多克隆抗体效价的测定本实验采用间接 ELISA法测定抗血清的效价，以 GST-GFP融合蛋白作为包被抗原，用 5%,的脱脂乳粉封闭后，以所得的抗血清为一抗，辣根过氧化物酶(HPR)标记的羊抗兔抗体为二抗，然后经过 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，利用酶标仪测定A450处的吸光度，并计算出抗血清的效价．以实验组血清A450与阴性对照血清A450的比值大于等于 2.0为阳性，其最高稀释度即为抗血清的效价[12–13]．1.6 多克隆抗体的纯化及特异性分析1.6.1 多克隆抗体的纯化分离完的抗血清首先使用Protein A SepharoseTMCL-4B亲和纯化专一性吸附IgG，去除IgG之外的其他抗体分子，纯化条件为：结合缓冲液(12,mmol/LNa2HPO4，8,mmol/L NaH2PO4，pH 7.0)，洗脱缓冲液(0.1,mol/L甘氨酸，pH 2.7)，流量 0.5,mL/min．收集吸收峰对应的洗脱液，用1,mol/L Tris-HCl(pH 9.0)将洗脱液pH调至中性．然后将Protein A SepharoseTM纯化完的抗体采用GST-GFP免疫亲和纯化法进一步纯化：将 GST-GFP融合蛋白固定在硝酸纤维素膜亲和纯化法进一步纯化[14]，随后经Western blot检测多克隆抗体的特异性．1.6.2 抗体特异性检测免疫印迹：取20,μg处理后的含有GFP表达的莱茵衣藻裂解上清液[15]、HEK293细胞裂解上清液[16]和E．coli细胞裂解上清液[17]加入1.5,μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE和电转印后，蛋白转移到NC膜上，5%,的脱脂奶粉封闭；多克隆抗体稀释度 1﹕1,000，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，稀释度为1﹕5,000，然后曝光压片显影(ECL法)[18]．2.1 pET28A-gfp 和pGEX-2T-gfp 原核表达载体的构建PCR扩增获得723,bp的片段，与GFP预期大小一致．将构建的 pGEX-2T-gfp 和pET28A-gfp重组表达载体进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，均获得条带大小为 723,bp的目的片段，并经测序验证序列完全正确，说明表达载体构建成功(图1)．2.2 融合蛋白的表达与纯化2.2.1 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的诱导表达在IPTG的诱导下，含有pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株会大量表达目的蛋白，菌体经超声破碎后获得全蛋白，所得全蛋白经低温高速离心分离上清液和沉淀，然后经电泳、染色、脱色后分别在约2.6×104和5.2×104处可以看到目的蛋白大量表达，且蛋白的表达主要在上清液中，其表达结果如图2所示．2.2.2 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的纯化6×His-GFP融合蛋白的表达主要为可溶性表达，因此将诱导表达后的菌体经超声破碎以及高速离心后取上清液，于含有Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料的重力柱中进行亲和纯化，由于融合蛋白所含有的6×His标签能够特异性与上述填料结合，因此经过洗涤、洗脱等步骤即得到目的蛋白(图3 (a))，可作为免疫动物所用抗原．同时，GST-GFP融合蛋白经亲和纯化后，还有两条杂带(图3 (b))，经分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化如图4 (a)所示，可以得到较纯的目的蛋白如图4 (b)所示，可作为后续抗体纯化用抗原．2.3 多克隆抗体的制备2.3.1 抗血清效价的检测用纯化得到的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔，经耳缘静脉少量采血，室温静置 2,h或4,℃过夜后获得析出血清，以间接 ELISA法测定抗血清的效价，利用酶标仪测定A450处的吸光度后计算出抗血清的效价，结果如图5 所示．由图5 可知，1号兔抗血清的效价大于 16,000，2号兔抗血清效价大于32,000，满足实验要求．2.3.2 抗血清灵敏度和特异性检测最终纯化的多克隆抗体能够正确地与莱茵衣藻、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的2.6×104大小的GFP蛋白特异结合，证明所制备的多克隆抗体具有很好的特异性，可专一性识别不同种属细胞中表达的GFP蛋白(图6)．GFP现在已经广泛应用在各个物种中作为标记蛋白进行细胞定位以及蛋白分析，因而开发适用于多种属细胞的 GFP抗体是非常有必要的．由于单克隆抗体的生产成本高、生产周期较长，所以开发具有成本优势的 GFP多克隆抗体就显得尤为迫切．本研究使用具有表达时间短、表达量高、蛋白较易纯化等优势[19]的大肠杆菌作为抗原制备的宿主．选择6× His(组氨酸)标签[20–21]纯化免疫原蛋白，由于其标签相对分子质量小，对免疫动物产生的免疫反应也比其他如GST、MBP标签小，产生的抗体特异性和灵敏性也会更高，有研究使用 GST-GFP 融合表达后使用凝血酶对融合蛋白进行酶切得到的[10]GFP蛋白作为免疫原，相比这种方法，本研究所采用的小相对分子质量标签亲和纯化后直接免疫动物具有更高效和经济的优势．对于抗血清的纯化，先采用亲和纯化，得到相应的 IgG，随后采用抗原抗体纯化，使用高纯度的GST-GFP融合蛋白作为抗原与亲和纯化后的抗血清进行2次亲和纯化，这种方法能有效地提高抗体的特异性和灵敏度，使最终得到的抗体具有非常高的特异性，而且可以对不同种属来源的 GFP蛋白进行特异性结合．由于 GFP广泛应用在原核和真核细胞中，本研究利用本实验室具有的莱茵衣藻、HEK293细胞以及大肠杆菌这3种来源的表达GFP的宿主对抗体特异性进行测试，结果表明该多克隆抗体特异结合人源、植物源和细菌中来源的表达 GFP蛋白．综上所述，本研究成功制备了 GFP多克隆抗体，并通过免疫印迹实验证实其具有很好的特异性，为 GFP的相关研究提供了实验基础．【相关文献】[1]Morise H，Shimomura O，Johnson F H，et al. 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兔多克隆抗体的制备流程
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1. 免疫原制备。
选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。
兔抗体的制备
兔抗体的制备
兔抗体的制备是一种常用的实验技术，其大致流程如下：
1. 免疫兔子：将目标蛋白注射到兔子体内，激发免疫反应。
2. 取血：待免疫反应充分发展后，采集兔子的全血。
3. 分离抗体：将采集的兔子全血离心分离出血清，在纯化工艺中将目标抗体分离出来。
4. 测定抗体效价：采用酶联免疫吸附法或者放射免疫分析法等方法测定抗体效价，以保证抗体的质量。
5. 应用抗体：制备好的兔抗体可用于免疫印迹、免疫组化、免疫沉淀等实验研究。
值得注意的是，兔抗体制备需要遵守严格的伦理和动物保护措施，以保证动物的福利和实验的合法性。
一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应用[发明专利]
![一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d897e15f65ce0508773213d3.png)
专利名称：一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：刘明,陆安,王晔娜,贺丙强,贾永兵
申请号：CN201610355105.8
申请日：20160526
公开号：CN105968194A
公开日：
20160928
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种动物用多效多克隆抗体，其按照如下方法制备：A、免疫原采用群组化的多元免疫原多肽，其至少包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的免疫原多肽或者通过取代、缺失、和/或添加一个或几个氨基酸从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的序列中衍生的具有免疫原性的序列；B、动物免疫，用步骤A的免疫原多肽免疫目标动物，取抗血清；C、多克隆抗体的获得，分离并提纯步骤B所得抗血清免疫球蛋白，得多克隆抗体。
本发明的多克隆抗体在制备禽畜疾病综合防治药剂和禽畜免疫增强药剂中具有广泛应用。
申请人：河北普德动物药业有限公司
地址：050025 河北省石家庄市鹿泉开发区符家庄东
国籍：CN
代理机构：北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：汤东凤
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兔多克隆抗体的制备（2020）
兔多克隆抗体的制备（2020）兔多克隆抗体的制备一、兔多克隆抗体1.多克隆抗体的概念抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。
2.兔多克隆抗体的优点1.制备体系成熟。
2.抗兔二抗产品丰富，商业化好，适合检测。
3.制备成本相对低廉。
3.为何选择兔子4.一般流程多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
二、兔多克隆抗体制备流程1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
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【关键词】 绿色荧光蛋白； 多克隆抗体；Ｆ－ｍｏｃ 固相肽合成
Ｐｒ ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｂｂｉｔ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｒ ｅｅｎ Ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｔ Ｐｒ ｏｔｅｉｎ
ＭＡ Ｘｉａｏ－ｙｕａｎ， ＴＥＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕｎ， ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ－ｙｕａｎ， ｅｔ ａｌ （ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００７８， Ｃｈｉｎａ）
１． 材料与方法 １． １ 质粒及细胞
ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 质粒购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司； ＨｅＬａ 细胞 为本实验室保存。 １． ２ 实验动物
２ ～３ ｋｇ 新西兰白兔， 雄性， 购自中南大学湘雅 医学院实验动物学部。 １． ３ 试剂及仪器
ＰＡＬ－ＰＥＧ－ＰＳ 树脂、Ｆ－ｍｏｃ－ａａ－ＯＨ（ ９－芴氧羰基 修 饰的氨基酸） 、ＨｏＢ（ｔ １－羟基苯并三唑， １－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎ－ ｚｏｔｒｉｚｏｌｅ） 、ＴＢＴＵ［ Ｏ（－ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ） －Ｎ， Ｎ， Ｎ′， Ｎ′－ｔｅ－ ｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ］ 、ＤＩＰＥＡ（ Ｎ， Ｎ－二 异丙基乙胺， Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ） 、ＤＭＦ（ 二甲基甲 酰胺， Ｎ， Ｎ－ ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ） 和哌啶购自 Ａｐｐｌｉｅｄ－ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 公司； ＴＦＡ（ 三氟乙酸， Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） 购自上海吉尔生化公司； 二巯基乙烷、苯甲硫醚、苯 甲 醚 和 弗 氏 佐 剂 购 自 Ｓｉｇｍａ 公 司 ； ＫＬＨ 购 自 Ｐｉｅｒｃｅ
选取健康新西兰雄兔 ２ 只， 第 １ 次免疫用弗氏 完全佐剂 ５００ μｌ 与抗原 ５００ μｌ 超声乳化完全后， 经 家兔背部皮下多点注射。１４ ｄ 后， 再用弗氏不完全佐 剂 ２５０ μｌ 与抗原 ２５０ μｌ 超声乳化完全， 经家兔腿部 肌肉多点注射。以后每隔 １４ ｄ 加强免疫 １ 次， 剂量 与第 ２ 次免疫相同， 经家兔背部、腿部交替注射。第 ４ 次免疫 １ 周后， 每只家兔耳缘静脉采血 １ ｍｌ， 进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测。如有特异性目标条带， 则再加强 免疫 １ 次， 间隔 １ 周后， 颈动脉采血 １２０ ｍｌ， ４℃放置 ２ ｈ， ４℃， １ ８００ ｇ 离心 １０ ｍｉｎ， 收集血清， 分装冻存。 １． ９ Ｗｅｓｔｅｒ ｎ ｂｌｏｔ 分析
马小渊 滕祥云 姚仲元 龙志高 潘乾 戴和平 邬伶仟 梁德生
·８９３· 【诊断制品】
【 摘要 】 目的 制备绿色荧光蛋白（ ＧＦＰ） 兔多克隆抗体。方法 选取 ＧＦＰ 免疫原性较强、保守性低的 ９８ ～１１７ 位氨基酸 序列， 利用 Ｆ－ｍｏｃ 法固相合成该段序列， 经高效液相色谱纯化， ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ 鉴定合成多肽的分子量后， 与匙孔血蓝蛋白（ ＫＬＨ） 偶联， 免疫新西兰雄兔， 制备抗血清， 并进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定。结果 合成的 ＧＦＰ 多肽经 ＭＡＬＤＩ－ ＴＯＦ－ＭＳ 分析， 分子量为 ２ ４９７． ９， 与理论值相符。１ ∶２００ 稀释的抗血清与转染 ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 质粒的 ＨｅＬａ 细胞表达的增强型 ＧＦＰ 在相对分子质量 ２７ ０００ 处有清晰 的杂交信号出现。结论 已成功制备了特异性较好的 ＧＦＰ 兔多克隆抗体。
将冻干的 ＧＦＰ 多肽溶于去离子水中， 反相 ＨＰＬＣ 过 Ｃ１８ 柱纯化， 流动相为水（ ０． １％ ＴＦＡ） ／ 乙腈（ ０． １％ ＴＦＡ） ， 收集主峰， ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ 鉴定分子量。 １． ７ 多肽与 ＫＬＨ 的偶联
按照 Ｐｉｅｒｃｅ 偶联试剂盒说明书， 将多肽与 ＫＬＨ 偶联， 所得产物浓度为 １ ｍｇ ／ ｍｌ， 分装冻存。 １． ８ ＧＦＰ 抗血清的制备
【Ａｂｓｔｒ ａｃｔ】 Ｏ ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ ＧＦＰ） ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｍ－ ｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｌｏｗｌｙ ｃｏｎｖｅｒｓｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ９８－１１７ ｏｆ ＧＦＰ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ Ｆ－ｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ． Ｃｏｕｐｌｅ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏ ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ ＫＬＨ） ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ｍａｌｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ． Ｃｏｌｌｅｃｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒａ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＧＦＰ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ２ ４９７． ９， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｖａｌｕｅ． Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｃｌｅａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ， ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ａｂｏｕｔ ２７ ０００， ｏｆ １ ∶２００ ｄｉｌｕｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｓｅｒａ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－ Ｎ１． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＧＦＰ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉ－ ｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ．
·８９４·
中国生物制品学杂志 ２００８ 年 １０ 月第 ２１ 卷第 １０ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８， Ｖｏｌ． ２１ Ｎｏ． １０
公 司 ； ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００ 购 自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ； ＤＭＥＭ 培养基购自 ＧＩＢＣＯ 公司； 新生牛血清购自杭 州四季青工程材料有限公司； ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 购 自 Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公 司 ； Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ／ ＨＲＰ 二 抗 购 自 ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ 公司； Ｐｉｏｎｅｅｒ 多肽合成仪和基质辅助 激 光 解 析 电 离 飞 行 时 间 质 谱（ Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐ－ｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ， ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ） 购自 Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 公司； 高效液相色谱（ ＨＰＬＣ） 仪购自 Ｗａｔｅｒｓ 公司。 １． ４ ＧＦＰ 多肽序列的选择
利用 ＤＮＡＳｔａｒ 软件中的 Ｐｒｏｔｅａｎ 分析 ＧＦＰ 多肽 序列， 找出免疫原性强的肽段， 在 Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔ 网站进 行 Ｂｌａｓｔ 分 析 ， 选 取 与 其 他 蛋 白 同 源 性 低 的 肽 片 段 （ ９８ ～１１７ 位氨基酸） ， 序 列 为 ： ＮＨ２－Ｉ－Ｆ－Ｙ－Ｋ－Ｄ－Ｄ－Ｇ－ Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｔ－Ｒ－Ａ－Ｅ－Ｖ－Ｋ－Ｆ－Ｅ－Ｇ－Ｄ－Ｃ－ＣＯＯＨ， 其 中 羧 基 端 的 Ｃ（ 半胱氨酸） 为额外加上， 以提供巯基与 ＫＬＨ 偶 联。 １． ５ ＧＦＰ 多肽的合成
将表达质粒 ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 在脂质体 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ 介导下转染 ＨｅＬａ 细胞， ３ ｈ 后， 更换含 １０％新 生牛血清的培养基， 继续培养 ２４ ｈ， 弃去培养基， 用
预冷的 ＰＢＳ 漂洗 ３ 次， 加入 １５０ μｌ 裂解液， ２ ×ＳＤＳ 上样缓冲液裂解细胞， １００℃煮沸 １０ ｍｉｎ， 冰上冷却， 进行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ ５％浓缩胶，１２ ％分离胶） 分离， 转至 ＰＶＤＦ 膜 。 将 膜 置 于 封 闭 液 中 ， 室 温 封 闭 １ ｈ， 加 入 １ ∶２００ 稀释的抗血清， 每份用量为 ２ ｍｌ； 其中 １ 份内 加 ５０ μｇ 纯化的 ＧＦＰ 多肽， 与血清反应 １ ｈ， 作为阴 性对照； １ ｈ 后 ＰＢＳ ／ ０． １％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ 洗涤 ３ 次， 每 次 １０ ｍｉｎ； 再加入 １ ∶１０ ０００ 稀释的二抗（ Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ／ ＨＲＰ） ， 室温作用 １ ｈ， 洗涤（ 方法同洗一抗） ， 加 入 ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ 反应 ５ ｍｉｎ， 包膜， 暗室 Ｘ 光片曝光， 显影。 ２． 结果 ２． １ ＧＦＰ 多肽的纯化及其分子量
合成的 ＧＦＰ 多肽的纯化图谱见图 １。收集 ２３ ｍｉｎ 的主峰， 经 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ 分析， ＧＦＰ 多肽的分子 量为 ２ ４９７． ９， 与理论值 ２ ４９７ 相符， 见图 ２， 表明多 肽合成正确。
基金项目： 国家自然科学基金（ ３０６００３３４） ． 作者单位： 中南大学医学遗传学国家重点实验室（ 长沙 ４１００７８） ． 通讯作者： 梁德生， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉａｎｇｄｅｓｈｅｎｇ＠ｃｎｌｍｇ．ｃｏｍ
匙孔血蓝蛋白（ Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ， ＫＬＨ） 偶联 制备免疫原， 免疫新西兰雄兔， 获得抗 ＧＦＰ 的多克隆 抗体， 可用于体外对 ＧＦＰ 的检测。