(参考课件)绿色荧光蛋白标记亚细胞定位
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法作者：于一帆朱小彬葛会敏陈云来源：《江苏农业科学》2014年第12期摘要：细胞是生命活动的基本单位，各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。
蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。
目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。
综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法，包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等，同时对上述几种方法进行了比较分析。
关键词：蛋白质；亚细胞定位；绿色荧光蛋白；瞬时表达中图分类号： Q-33文献标志码： A文章编号：002-302（204）2-0058-04蛋白质是生物功能的直接体现者，有序分布、动态调控的蛋白质是保证生命个体正常生长发育的前提。
基因表达产物在组织中的亚细胞定位是功能基因组学、蛋白质组学的重要研究内容之一，是系统理解植物形态建成、生长发育以及对逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的环节，也是生物学家们初步推断蛋白质生物学功能的重要依据。
蛋白质的亚细胞定位可采取多种方法，包括生物信息学预测、免疫胶体金标记[2]、多肽序列分析[3]以及与报告基因融合瞬时表达[4]等。
目前植物蛋白的亚细胞定位应用主要是借助于融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GF）应用最为广泛。
瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪融合产物在细胞内的运输、亚细胞定位及代谢[5]。
GF是水母（Aequorea victoria）体内的天然蛋白，自994年Chalfie等揭示了该蛋白作为报告蛋白的潜在应用价值[6]以来，已作为报告蛋白在多种植物、动物、微生物中成功获得表达。
由于GF作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分，也不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪、分选表达GF的细胞；同时可以在活细胞中进行图像分析，在固定细胞中进行检测[7]。
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白亚细胞定位是研究细胞内蛋白质在细胞中的定位和运输过程的重要领域。
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）和红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，简称RFP）是经常被使用的一对标记蛋白，它们在细胞内可以通过荧光显微镜观察到不同的荧光信号，从而帮助研究者揭示蛋白质的定位和运输。
GFP最早由日本科学家下村脩在1962年研究海葵(Aequorea victoria)中的荧光蛋白而获得，并于1992年被将其克隆到其他生物系统。
GFP的一个重要特点是它在没有外源激发剂的情况下就可以自行发出荧光。
GFP可以通过其自身的三肽序列引导，与细胞内的目标蛋白连接在一起。
当GFP连接在目标蛋白后，细胞内目标蛋白的表达和定位就可以通过荧光显微镜直接观察到。
基于GFP的定位系统被广泛应用于其他蛋白质的研究中。
RFP也是一种荧光蛋白，其最早是从珊瑚Disocora unifora中分离得到的。
RFP和GFP有相似的结构，但它们有不同的激发和发射波长。
RFP发射波长较长，通常在560-620nm之间。
RFP也可以被编码到目标蛋白上并通过荧光显微镜观察到。
GFP和RFP在细胞内的应用主要有两个方面：1.追踪蛋白质的定位和运输；2.研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。
在细胞定位和运输方面，通过将GFP或RFP连接到目标蛋白上，可以观察到这些蛋白质在细胞中的分布情况。
比如，可以通过将GFP连接到细胞器膜上的蛋白质上，来观察这些细胞器在细胞中的定位和运输过程。
通过追踪GFP或RFP的荧光信号，我们可以了解蛋白质在细胞内的运输速度、路径以及转运机制。
此外，GFP和RFP还可以被用来研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。
通过将GFP和RFP连接在两个相互作用的蛋白质上，可以根据不同的荧光信号来观察这两个蛋白质的相互作用情况。
另外，通过将GFP和RFP连接在目标蛋白的不同区域上，可以研究蛋白质的拓扑结构，比如膜蛋白的跨膜结构等。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用课件
3 GFP的稳定性
❖ GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用 放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10μg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生 质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分 GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的 消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧 光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤嘿，伙计们！今天我们要聊聊一个非常有趣的话题——gfp融合蛋白亚细胞定位步骤。
让我给大家简单介绍一下什么是gfp融合蛋白。
GFP融合蛋白，就是把绿色荧光蛋白(gfp)和别的蛋白质结合在一起，形成一个新的蛋白。
这个新的蛋白有个特点，就是它可以在显微镜下发出绿色的荧光。
这对于我们研究细胞内部的结构和功能非常有帮助哦！那么，我们怎么才能让这个gfp融合蛋白在细胞里找到它的“家”呢？这就需要我们进行亚细胞定位步骤了。
接下来，我就会给大家一步一步地讲解这个过程。
我们要让这个gfp融合蛋白进入到细胞里面。
这可不是一件容易的事情，因为细胞的大门可是紧紧关着的。
但是，我们有办法。
我们可以先把这个gfp融合蛋白包在一层叫做脂质体的膜上，然后再把它送进细胞。
这样一来，gfp融合蛋白就顺利地进入了细胞啦！接下来，我们要让这个gfp融合蛋白在细胞里“游走”。
这就像是在大海里游泳一样，我们需要知道它在哪里才能找到它。
所以，我们就要用一种叫做荧光显微镜的技术来观察这个gfp融合蛋白。
荧光显微镜是一种可以发出绿色荧光的显微镜，它可以帮助我们看到细胞内部的结构和活动。
通过荧光显微镜，我们就可以找到gfp融合蛋白的位置了！找到了gfp融合蛋白的位置之后，我们还要让它“回家”。
这就像是在玩捉迷藏一样，我们要把gfp融合蛋白从一个地方带到另一个地方。
这个过程叫做转移。
我们可以通过一些特殊的方法来实现gfp融合蛋白的转移，比如说使用一种叫做化学载体的方法。
这种方法可以把gfp融合蛋白从一个细胞转移到另一个细胞，就像快递一样方便！我们要让这个gfp融合蛋白在目标位置发挥作用。
这就像是让它去完成一项任务一样。
我们可以通过观察gfp融合蛋白在目标位置的活动来了解它的功能。
这样一来，我们就可以知道这个gfp融合蛋白到底是怎么工作的了！好了，各位小伙伴，今天的亚细胞定位步骤就讲到这里啦！希望大家对gfp融合蛋白有了更深入的了解。
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤1. 什么是GFP融合蛋白？好啦，咱们先聊聊GFP融合蛋白到底是什么。
简单来说，GFP（绿色荧光蛋白）就是个能发绿光的小家伙，它可在各种生物中找到，像小水母、海洋生物这些。
科学家们聪明地把这个小家伙跟其他蛋白质绑在一起，形成了GFP融合蛋白。
这就像给一件衣服加了个炫酷的荧光装饰，立刻吸引了眼球！所以，我们用这个融合蛋白就能观察细胞内各种蛋白质的“动静”，就像透过玻璃窗看邻居家的热闹一样。
1.1 GFP的魅力GFP的魅力可不止于此哦！首先，它不需要任何特殊的染料或化学试剂，照个光就能发光，真是方便得不得了。
其次，GFP的荧光特性非常稳定，不容易被破坏，基本上是个“长青树”，只要好好照顾，能陪你很久。
想想，如果能在细胞中像放烟火一样观察到蛋白质的动态，那是多么酷的事情啊！这可是科学研究中的“火箭发射”，瞬间提升了研究效率。
1.2 GFP融合蛋白的用途接下来，咱们聊聊这个融合蛋白的用途。
科学家们可以利用它来研究细胞的结构、功能，甚至是信号传递。
比如说，你想知道某个蛋白质是不是在细胞膜上，还是在细胞质里，嘿，简单！只需把GFP和目标蛋白结合，就能轻松找到它的位置。
就像在找女儿的玩具一样，轻松又愉快。
2. 亚细胞定位的步骤现在我们要进入正题，怎么把这GFP融合蛋白带到细胞里，进行亚细胞定位呢？这个过程听起来挺复杂，但其实很有趣，像个探险游戏。
2.1 设计融合蛋白首先，咱们得设计融合蛋白。
这个过程就像做菜，得有主料和辅料。
你得选定目标蛋白，然后把GFP“嫁接”上去。
这一步是关键，得确保融合后的蛋白能正常工作，不然就像做了道菜，结果食材不新鲜，味道全无。
通常，科学家们会利用基因工程的技术，把GFP和目标蛋白的基因拼接在一起，形成一个完整的DNA序列。
完成后，你就得把这个序列送入细胞里。
2.2 转染细胞转染细胞是个很重要的步骤。
想象一下，咱们把这个DNA序列像一封信一样送到细胞里。
常见的转染方法有病毒转染、脂质体转染等等。
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法_于一帆
江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 12 期
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统，由于没有细胞壁等特点，它可以排除细胞之间的相互影 响，单独考察 1 个细胞的全能性。原生质体是 1 个均一性程 度很好的群体，并且在短时间内就能获得大量原生质体。原 生质体是 1 个理想的试验系统，由于不受植物细胞壁的限制， 其质膜经一定处理可以摄取外源物质（ 如细胞器、病毒、DNA 等） ，是遗传转化的理想受体系统［11］。研究表明，不同植物材 料所得到的原生质体可以保持原组织的生理生化特性，可以 取代植物组织作为理想的试验材料。 1． 1 PEG － Ca2 + 介导转化法
lus： vol． 707［M］． New York： Wiley，1990．
Байду номын сангаас
［9］Stülke J，Hillen W． Ｒegulation of Carbon catabolism in Bacillus spe-
［6］Ye Ｒ Q，Kim J H，Kim B G，et al． High evel secretory production of
脂质体介导转化法是将质粒 DNA 包裹在脂质体中，然后 与原生质体接触融合而把外源 DNA 带入原生质体的 1 种方 法。脂质体是 1 种由磷脂、胆固醇、脂肪酸等脂类分子组成的 球形膜囊结构，可将 DNA、ＲNA 等大分子物质包在脂质体内， 免受细胞内核酸酶的降解。脂质体可做成单层、双层或多层。 脂质体进入原生质体主要发生在脂质体与原生质体共培养的 起始 2 h，共培养 90 min 后，加入一定浓度的 PEG 能提高脂质 体、原生质体融合的频率。 1． 4 植物病毒载体介导法
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法
于一帆，朱小彬，葛会敏，陈 云
绿色荧光蛋白gfp标记方法参考PPT
2021/5/9
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二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
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GFP标记
菌落观察
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油镜观察
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本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
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一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
绿色荧光蛋白(GFP)PPT课件
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2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
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2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
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2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
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绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
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生物化学精品课程
问题的提出
一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物 理状态
但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的 的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白， 以利用了解以下信息
1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用
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生物化学精品课程
荧光亚细胞定位的应用
荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位
Actin
endoG-YFP (apoptotic endonuclease)
Debrin
Mitochondria
Colocalization
Apop扬to州si大s学12生物(7科):学11与5技5术-1学17院1, 2007
这些问题能够通过以下实验揭示 (1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移
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生物化学精品课程
荧光蛋白标记细胞定位
将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色 荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位
限制性内切酶位点
启动子
目的蛋白基因
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实验方法
1. 克隆目的基因的开发阅读框 2. 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一
般选用pEGFP系列质粒载体） 3. 将质粒转染细胞 4. 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细
胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例 如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染 色或线粒体染色。
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生物化学止子
Linker (poly-G)
P EGFP
Target
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3
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荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄 的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意 光线。
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