绿色萤光蛋白

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绿色荧光蛋白简述

绿色荧光蛋白简述

四、骨
架和 细胞 分裂
1、酵母菌内SPB 和微管动力学 2、酵母菌中肌动蛋白的动力 3、果蝇中MEI-S332蛋白 4、网丙菌属细胞骨架动力,细 胞运动,趋化作用,细胞骨架 动力,细胞动力
网丙菌属中细胞骨架 动力和细胞运动.gif
12
五、 在其 他方 面的 应用
1、在肿瘤发病机制研究 中的应用 2、在信号转导中的应用 3、在生物防治中的应用 4、在生态学中的应用 5、目的基因的功能研究 6、作为报告基因构建基 因工程载体 7、神经生物学等
•⑥增加荧光强度和热稳定性,促进了生色 团的折叠,其荧光特性也得到了改善。 •因为GFP分子质量小,能够在异源细胞中稳 定表达并发射荧光,不需要任何辅助因子参 加,对细胞没有毒性,因而将会得到广泛应 用。随着人们对GFP的基础理论研究的进一 步深入和新型突变体的不断出现,有理由相 信GFP将会绿色荧光蛋白(GFP)
—21世纪的显微镜
绿色萤光蛋白 (green fluorescent protein)
基本介绍
GFP性质
GFP应用
应用前景
3
基本介绍
• 绿色荧光蛋白(green fluor escent protein),简称GFP, 是一种化学性能稳定的小分 子蛋白质(分子质量为26kD a,由238个氨基酸构成 ) 在蓝色波长范围的光线激发 下,会发出绿色萤光 • 1962年由下村修等人,在维 多利亚多管水母(Aequorea vi 囊运输
三 、 发 育 生 物 学
1、用GFP显示小囊运输 2、用GFP观察TGN运输 3、细胞骨架动力学和胞内运输
1、用GFP观察线虫的神经发育 2、分析果蝇神经发育的不对称性细胞 分裂 3、用GFP观察网丙菌属的形态发生学 4、 GFP在小鼠发育中的标记方法

荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式

荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式

荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式荧光蛋白(GFP)是一种广泛应用于生物领域的重要工具。

其中,绿色荧光蛋白(EGFP)是最常用的一种变异型。

EGFP的计算公式如下:EGFP = (0.299 * R) + (0.587 * G) + (0.114 * B)其中,R、G、B分别代表红、绿、蓝三个通道的亮度值。

这个公式的作用是根据RGB值计算出EGFP的亮度值,从而确定样品中EGFP的强度。

EGFP作为一种荧光探针,广泛应用于细胞和分子生物学研究中。

它拥有许多优点,如亮度高、稳定性好、光谱特性窄、抗褪色性强等。

通过对EGFP的表达和检测,可以实现对细胞和分子过程的实时观察和定量分析。

EGFP的计算公式中,红、绿、蓝三个通道的权重分别为0.299、0.587和0.114。

这是由于人眼对不同颜色的敏感度不同,绿色的敏感度最高,红色次之,蓝色最低。

因此,在计算EGFP亮度值时,对于红、绿、蓝三个通道的亮度值进行加权处理,以更准确地反映EGFP的亮度。

EGFP的计算公式不包含任何网络地址,是基于对颜色通道的数学处理得出的。

这个公式在生物学研究中广泛应用,但在具体实验中,可能会根据实际情况进行微调。

例如,通过改变权重值,可以调整EGFP的亮度范围,以适应不同实验需求。

除了EGFP,还存在许多其他荧光蛋白变异型,如黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)等。

它们的计算公式和EGFP类似,只是权重值不同,以适应不同荧光蛋白的光谱特性。

荧光蛋白作为一种重要的生物标记物,已经被广泛应用于生物学研究中。

通过对荧光蛋白的表达和检测,可以实现对细胞和分子过程的实时观察和定量分析。

荧光蛋白的计算公式是对荧光强度的定量化处理,可以帮助研究人员更准确地获得实验数据,推动科学研究的发展。

总结起来,荧光蛋白参数EGFP的计算公式是根据红、绿、蓝三个通道的亮度值来确定EGFP的亮度。

这个公式在生物学研究中被广泛应用,通过对荧光蛋白的表达和检测,可以实现对细胞和分子过程的实时观察和定量分析。

gfp绿色荧光蛋白序列_概述及解释说明

gfp绿色荧光蛋白序列_概述及解释说明

gfp绿色荧光蛋白序列概述及解释说明1. 引言1.1 概述GFP(绿色荧光蛋白)是一种具有独特发光特性的蛋白质,被广泛应用于细胞和分子生物学领域。

其绿色荧光可以通过外源激活而观察到,使得科学家们能够可视化细胞内发生的过程,并实时跟踪靶标分子的定位与转移。

GFP的序列是理解其结构、功能以及应用关键的基础。

1.2 文章结构本文将从多个方面对GFP绿色荧光蛋白序列进行概述及解释说明。

首先,我们将介绍GFP的历史和发现过程,以及其在现代生物学中的重要性。

随后,我们将详细探讨GFP序列的组成和编码基因信息,并解析与功能相关性方面的研究进展。

最后,我们将阐述GFP序列在生物学研究中的广泛应用,并就目前存在的问题和未来发展进行思考。

1.3 目的本文旨在提供有关GFP绿色荧光蛋白序列的全面概述及解释说明,深入探讨其组成、结构、功能和应用,并对其未来发展进行展望。

通过本文的阐述,读者将能够更好地理解和应用GFP序列在生物学领域中的价值,为相关研究提供指导和启示。

同时,我们也希望通过此文促进对GFP技术的探索和创新,推动生物科学的不断发展。

2. GFP绿色荧光蛋白序列概述2.1 GFP简介GFP(Green Fluorescent Protein)绿色荧光蛋白是一种来自于海洋水母的蛋白质。

它的主要特点是能够发出绿色荧光,并且在非生物致死条件下仍然保持稳定。

由于这些特性,GFP成为了生物学领域中一种广泛使用的标记工具。

2.2 GFP的发现历程GFP最早是在1960年代末期由奥斯汀·盖因斯、罗德南·麦迪安和道格拉斯·普里肯特等科学家在研究水母Aequorea victoria时发现的。

他们观察到当GFP暴露在紫外线下时会发出绿色荧光,并且将其提取出来进行进一步研究。

随后,科学家们发现GFP能够自身形成一个染色体,而不需要其他辅助物质。

2.3 GFP的结构特征GFP的序列长约238个氨基酸残基,具有高度保守性。

亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白

亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白

亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白亚细胞定位是研究细胞内蛋白质在细胞中的定位和运输过程的重要领域。

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,简称GFP)和红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,简称RFP)是经常被使用的一对标记蛋白,它们在细胞内可以通过荧光显微镜观察到不同的荧光信号,从而帮助研究者揭示蛋白质的定位和运输。

GFP最早由日本科学家下村脩在1962年研究海葵(Aequorea victoria)中的荧光蛋白而获得,并于1992年被将其克隆到其他生物系统。

GFP的一个重要特点是它在没有外源激发剂的情况下就可以自行发出荧光。

GFP可以通过其自身的三肽序列引导,与细胞内的目标蛋白连接在一起。

当GFP连接在目标蛋白后,细胞内目标蛋白的表达和定位就可以通过荧光显微镜直接观察到。

基于GFP的定位系统被广泛应用于其他蛋白质的研究中。

RFP也是一种荧光蛋白,其最早是从珊瑚Disocora unifora中分离得到的。

RFP和GFP有相似的结构,但它们有不同的激发和发射波长。

RFP发射波长较长,通常在560-620nm之间。

RFP也可以被编码到目标蛋白上并通过荧光显微镜观察到。

GFP和RFP在细胞内的应用主要有两个方面:1.追踪蛋白质的定位和运输;2.研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。

在细胞定位和运输方面,通过将GFP或RFP连接到目标蛋白上,可以观察到这些蛋白质在细胞中的分布情况。

比如,可以通过将GFP连接到细胞器膜上的蛋白质上,来观察这些细胞器在细胞中的定位和运输过程。

通过追踪GFP或RFP的荧光信号,我们可以了解蛋白质在细胞内的运输速度、路径以及转运机制。

此外,GFP和RFP还可以被用来研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。

通过将GFP和RFP连接在两个相互作用的蛋白质上,可以根据不同的荧光信号来观察这两个蛋白质的相互作用情况。

另外,通过将GFP和RFP连接在目标蛋白的不同区域上,可以研究蛋白质的拓扑结构,比如膜蛋白的跨膜结构等。

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白

GFP性质 性质
荧光极其稳定。在激发光照射下, 荧光极其稳定。在激发光照射下,GFP抗光漂白 抗光漂白 (Photobleaching)能力比荧光素 能力比荧光素(fluorescein)强,特别在 能力比荧光素 强 450~490nm蓝光波长下更稳定。 蓝光波长下更稳定。 ~ 蓝光波长下更稳定 需要在氧化状态下产生荧光。强还原剂能使GFP转变为 需要在氧化状态下产生荧光。强还原剂能使 转变为 非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中, 非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光 荧光 便立即得到恢复。 便立即得到恢复。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高, 融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高, 融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高 抗光漂白能力强,适用于定量测定与分析 抗光漂白能力强 适用于定量测定与分析 。 荧光的产生不需要任何外源反应底物。 荧光的产生不需要任何外源反应底物。 故 GFP作为一种 作为一种 广泛应用的活体报告蛋白, 广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋 白无法比拟的。 白无法比拟的。
绿色荧光蛋白
(green fluorescent reen 绿色萤光蛋白 fluorescent protein),简 , 称GFP,这种蛋白质最早 , 是由下村修等人在1962年 是由下村修等人在 年 在一种学名Aequorea 在一种学名 victoria的水母中发现。 的水母中发现。 的水母中发现 其基因所产生的蛋白质, 其基因所产生的蛋白质, 在蓝色波长范围的光线激 发下,会发出绿色萤光。 发下,会发出绿色萤光。 这个发光的过程中还需要 冷光蛋白质Aequorin的帮 冷光蛋白质 的帮 助,且这个冷光蛋白质与 钙离子(Ca2+)可产生交互 钙离子 可产生交互 作用。 作用。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质,可以发射绿色荧光。

由于GFP具有结构简单,对细胞无毒性和较强稳定性等特点,因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。

以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。

一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质,能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。

GFP最初是在1955年,美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。

GFP由238个氨基酸组成,分子量约27kDa。

GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达,使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。

二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr(酪氨酸)、Ser(丝氨酸)和Gly(甘氨酸)构成的环状结构决定。

当氧气与Tyr形成共轭键时,便使荧光激发能量被吸收,并在GFP分子腔内缓慢扩散,直至荧光发射。

三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。

由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性,可以将其组装到生物体内,使其具有明亮的绿色荧光。

通过转化所需的基因序列来表达GFP,可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。

2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。

在这种情况下,GFP被连接到研究的蛋白质上,而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况,从而确定蛋白质之间是否相互作用。

3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。

通过表达GFP基因,可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。

4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。

通过转染GFP基因,可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置,比如细胞分裂、游走和迁移等。

dfhbi 1t类绿色荧光蛋白

dfhbi 1t类绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)是一种具有绿色荧光的蛋白质,广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。

绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。

在这篇文章中,我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。

1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria(水母)发光器官中分离出来的一种蛋白质。

根据不同的来源和结构特点,绿色荧光蛋白可以分为多种类别,包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。

每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。

2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。

它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质,包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。

在特定的条件下,它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团,并发出绿色的荧光。

绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。

3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物,绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织,以便于研究者对其进行观察和分析。

通过转基因技术,研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中,从而实现对其活体成像和实时监测。

绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。

4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面:a. 细胞成像与实时监测:通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中,可以实现对其活体成像和实时监测,从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。

b. 蛋白质定位与跟踪:通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质,可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪,从而研究其功能和代谢途径。

c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究:利用双融合蛋白技术或FRET技术,可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析,为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。

绿色荧光蛋白和荧光素发光原理

绿色荧光蛋白和荧光素发光原理

绿色荧光蛋白和荧光素发光原理1. 引言:荧光的魅力说到发光,大家脑海中是不是会闪现出五光十色的景象?比如夜空中的星星、深海中的生物,甚至是那些可爱的小虫子们。

今天,我们就来聊聊“绿色荧光蛋白”和“荧光素”的发光原理。

这俩家伙可不简单,它们在科学界可是赫赫有名!就像小朋友们喜欢的超级英雄一样,它们都有各自的“超能力”。

那么,这些荧光家伙到底是怎么让我们眼前一亮的呢?2. 绿色荧光蛋白(GFP)2.1 GFP的起源绿色荧光蛋白,简称GFP,最初是从一种海洋水母中发现的。

想象一下,这水母在海里游来游去,随时随地都能发出迷人的绿色光芒,简直就像海底的明星!后来,科学家们把这个神奇的蛋白提取出来,发现它在研究生物体时可以发挥大作用。

比如,它可以标记细胞,帮助研究人员观察细胞的活动,真是个无敌的小帮手。

2.2 GFP的发光原理那么,GFP是怎么发光的呢?这就要提到它的结构了。

GFP里有一种叫“色氨酸”的氨基酸,平时看起来毫不起眼,但它一遇到特定的光照,就开始“激动”起来。

经过一番“舞动”,它就会释放出能量,变成美丽的绿色光芒。

就好比一颗小星星在黑夜中闪烁,光彩夺目。

这种发光过程,我们称为“荧光”。

而且,GFP是相对稳定的,能在细胞中长时间发光,所以它被广泛应用于各种生物研究中。

3. 荧光素(Fluorescein)3.1 荧光素的介绍说到荧光素,大家可能觉得这个名字听起来有点陌生,但它可是在化学界里炙手可热的存在!荧光素是一种合成染料,颜色多样,最常见的当然是鲜艳的绿色。

它广泛应用于医学、环保监测,甚至是材料科学。

这玩意儿就像一位多才多艺的明星,能够在不同的场合展现自己的才华。

3.2 荧光素的发光原理荧光素的发光原理和GFP有点相似,但又各有千秋。

它的分子结构里有多个共轭双键,这些双键就像一条条“小桥”,让电子在分子间自由游走。

当荧光素被激发光照射时,这些电子就会快速跃迁,随后又很快回到原来的状态,同时释放出能量,形成荧光。

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绿色萤光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。

其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。

这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。

由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置。

由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点。

在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。

一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法。

我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。

标记细胞GFP的分子结构和发光机制绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链,GFP有两个吸收峰,主峰在395nm,次峰在470nm,其荧光发射峰在509nm。

GFP 的化学性质相当稳定,其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理,这一性质与GFP的结构特性相关。

Yang等的研究表明,GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体,β-桶状结构直径约3nm,高约4nm。

β折叠彼此紧密结合,象桶板一样形成桶状结构的外围,并且形成了一个规则的氢键带。

桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域,没有可供扩散的配体进入缝隙。

这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。

GFP的生色基团附着于α-螺旋上,几乎完美的包被于桶状结构中心。

位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心,而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。

GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果,环化是一个有氧过程,在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光,因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。

生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射,此模型为Yang等的晶体学证据所支持。

GFP在生物技术中的应用研究1.分子标记作为一种新型的报告基因,GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制,可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging),即利用DNA重组技术,将目的基因与GFP基因构成融合基因,转染合适的细胞进行表达,然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

由于GFP相对较小,只有238个氨基酸,将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能,利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解,如细胞分裂、染色体复制和分裂,发育和信号转导等。

1996年,Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。

研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物,且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用,尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚,但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。

利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

除用于特定蛋白的标记定位外,GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白,这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。

这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法,成为交叉学科研究的热点。

2.药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选,这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。

基于细胞的荧光分析可分为三类:即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能,将一荧光蛋白与信号分子相偶联,根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况,并推断该分子在迁移中的功能。

由于GFP分子量小,在活细胞内可溶且对细胞毒性较小,因而常用作荧光探针。

在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂,其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。

例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域,而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。

因而,这些受体常常被用作药物筛选的目标,若某一药物具有与信号分子类似的功能,那么该药物即具有潜在的医药价值。

利用GFP荧光探针,将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能,且这一筛选过程简单方便,所需成本也很低。

利用这一原理,已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。

在一96孔板中培养细胞,并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。

当细胞用待筛选的药物处理后,hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实,根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。

利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联,其筛选容量相对较低,但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制,因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。

3.融合抗体近二十年来,抗体生成技术有了飞速发展,已经从细胞工程抗体(杂交瘤技术一单克隆抗体)发展到了第三代抗体:基因工程抗体,尤其是噬菌体抗体库技术的出现,解决了人源抗体的研制问题,促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。

单链抗体(Single-chain variable fragment,ScFv)是研究得较多的一种小分子抗体,其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达,易于基因工程操作,尤其易于构建抗体融合蛋白。

近年来,关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多,国内也有相关报道,如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。

因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性,故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂,直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

由于技术上的的原因,一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。

为便于表达蛋白的分离纯化,一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列,便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。

但这一技术也存在一些问题。

由于抗体分子内存在二硫键,而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠,容易形成包涵体,表达出来的目标蛋白无活性,需要在氧化还原体系中进行复性。

但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。

若能成功解决融合抗体的表达问题,则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

4.生物传感器蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。

绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制,以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性,因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。

第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器,由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。

这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。

但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化,为克服这一缺点,人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。

Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla)融合到GFP上。

当缺少目标分子时,GFP处于静止状态不会产生荧光。

但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)与Bla结合后,即使GFP活化产生荧光,而这一变化很容易被检测到。

将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具,这种GFP感受器能被用来检测多种分子,如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等,其潜在应用前景极为广阔。

GFP在细胞方面的应用生物发光Protein taggingGFP蛋白首先被应用在观察活体细胞中蛋白的位置及动态的变化.使用GFP进行此类研究的好处是细胞在实验之前不需要进行固定或破坏,如此便能在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析.主要可以应用在Biological screen及Drug screen上.GFP蛋白除了能在细胞中标定特定fusion protein的位置及存在,另外也能利用生物分子之间的特殊作用力标定特定DNA序列的位置.例如有研究就利用bacterial lac repressor protein(lac I)跟其DNA目标之间的特殊强结合力来标定lacI的目标基因.GFP的barrel-like structure能确保GFP在fusion protein中的结构及其发光的性质,使其适宜接在不同fusion protein中表现.但利用GFP有期限制性,因为要将GFP折叠成具有活性(会发光)的形状可能会花较长的时间,这使得应用GFP在短生命周期的蛋白研究中相形困难. Monitoring of gene expression将GFP当作报告子基因在生医研究上有很多的应用,主要分成下列两种:1、测知transcriptase或reverse transcriptase的存在在文献报道,利用具有hTERT (human Tolemerase Reverse Transcriptase)作用之promoter及拥有在此promoter下游GFP报告子基因的adenovirus来感染细胞,进而利用萤光的发光位置来辨认出肿瘤细胞的存在及其位移,发展的过程.2、Promoter强度之研究Promoter强度及其作用之研究对於有用到Molecular Cloning的实验来讲是非常重要的.利用GFP当作下游之reporter gene可以让研究者即时观察得知promoter在不同细胞或在不同状况下表现下游基因的能力.FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)利用Fluorescent Energy donor及acceptor之间的能量传递而造成发光波长的改变来得知donor和acceptor之间的相对位置关系,进而作为蛋白间交互作用研究的有力证据及资料.。

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