多克隆抗体的制备 实验报告
免疫实验报告王鹏
高级免疫学课程实验学生姓名王鹏学号1009系别动物科学技术学院专业基础兽医学任课教师李焕荣副教授2011年06月01日多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定实验一多克隆抗体的制备一实验目的1．加深对抗体基本知识的了解。
⒉了解多克隆抗体的制备方法。
二实验原理1.抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B细胞产生多克隆抗体。
在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。
如果抗原同免疫佐剂一同注入，佐剂将加强抗原的刺激效果，使家兔表达更多的抗体，其血清中的抗体浓度也会明显升高。
佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，本次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1混合，再与抗原溶液以1：1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。
佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用ELISA检出。
2.双向免疫扩散实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。
观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。
3.ELISA原理（免疫酶链反应吸附实验）该技术属于免疫酶技术。
酶免疫技术是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
4、抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。
在进行抗原抗体反应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。
蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在10000以上。
一般而言，相对分子质量越大，结构越复杂，免疫原性越强。
免疫血清的制备实验报告
1）取一只接种过的大白兔固定于兔笼，耳缘静脉注射合适剂量的麻醉剂麻醉。将麻醉后的大白兔固定于兔台，用棉线固定四肢，细线固定门牙于铁柱，使颈部完全暴露。
2）用剃毛剪贴着皮肤减去颈部的毛，手术刀在颈部中央切开皮肤约3-4cm，纱布吸去多余的血液。用止血钳提拉住两边的皮毛，组织剪将切口扩大至7-8cm。分别剪开黏膜层、肌肉层，用止血钳扩大开口使之与皮肤一致，游离出颈动脉约2-3cm。
实验报告
实验名称
多克隆抗体的制备一（抗
班 级
姓 名
学 号
一、实验目的
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材
试剂：
酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂
器材：
兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
四、实验过程及步骤
1.免疫接种
1）取一只健康大白兔固定在兔笼中
2）酒精消毒大白兔皮肤后，通过皮下或皮内注射方式接种大白兔，共计注射8-10个位置，每一处约0.1ml。
3）为提高免疫血清效价，通常需要进行2-3次加强免疫，每次免疫间隔10-15天。然后再接免疫结束后的血清采集过程。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。
(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。
用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。
(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。
初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。
(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。
使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。
每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。
9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。
(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。
用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。
用PBS-Tween洗6次。
(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。
实验十四大肠杆菌多克隆抗体的制备与检测
四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴1h →稀释达9 亿个/毫升→无菌检查 • 2、免疫血清的制备 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应
实验十四 大肠杆菌多克隆抗体的制备与检测
一、实验目的
• 1、学习掌握多克隆抗体制备原理与方法 • 2、学习掌握凝集反应原理与方法
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原(多个抗原表位)机体诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体
2、凝集反应
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等
免疫学实验 多抗制备2-加强免疫
初次应答（primary response) ：
1. 是抗原第一次进入机体时引起的应答。 2. 特点：
①潜伏期长（1～2周） ②主要产生低亲和力的IgM类抗体 ③抗体浓度低 ④维持时间较短
再次应答（secondary response) ：
1. 是机体再次接触相同抗原时的应答。 2. 特点：
①潜伏期短，约为初次应答的一半。 ②主要产生高亲和力的IgG类抗体 ③抗体浓度高 ④维持时间长
实验四 多抗制备（加强免疫1）
第一部分 多抗制备（加强免疫1）
一、实验目的 1.掌握多克隆抗体的应答特点。 2.理解加强免疫的作用和必要性。
二、实验原理
1. 抗体产生的一般规律 体液免疫应答过程中，B细胞对抗原刺激的应答可 分为两种不同的情况，即在初次接受抗原刺激时， 机体发生初次应答（primary response) ；再次接 受相同抗原刺激，机体产生再次应答（secondary response)或称回忆应答（anamnestic response) 。
2.加强免疫的作用和必要性：
再次答，增加抗体量，增强抗体的亲和 力。
三、材料和试剂
• 试剂：伤寒杆菌O抗原应用液 • 材料：注射器、消毒棉球
四、实验方法
对基础免疫的同一只兔子进行加强免疫， 方法同基础免疫。即用注射器取伤寒杆菌O 抗原应用液1.5ml做静脉注射。
制备多克隆抗体(2 至 3 个月)
制备多克隆抗体（2 至 3 个月）实验动物：2 只大耳兔；●∙顾客方需提供抗原样品> 5 mg,纯度> 90 %.抗原经SDS-PAGE 检测。
若达不到要求的抗原顾客仍坚持启动项目，风险由顾客承担；●∙多次免疫兔子，每次测定效价（ELISA），数据最后一并提供给顾客；●∙提供最后一次免疫的抗血清20 ml，若量需要增加，收费另外增加；若需要提供免疫前的血清，需预先说明，并相应增加费用￥300，一般提供 1 至 2 ml；●∙验收方式：通过ELISA 方法进行检验；●∙验收标准：制备的多克隆抗体与客户方提供的抗原样品有特异性结合，同时抗体特异性只针对客户方提供的抗原样品做出保证；●∙如需做小鼠或其他动物的多克隆抗体，请与我们联系，收费标准另议。
●∙以上收费仅限于提供兔子抗血清。
最终提供：20 ml兔子的抗血清，效价在1：10，000以上，并给出相应的ELISA 鉴定报告。
制作及运输过程中，抗血清均在-20 ℃保存。
纯化多克隆抗体（1周）纯化方法Cat. No. 价格（人民币）多克隆抗体纯化（饱和硫酸氨法）CS0017 ￥500 / 20 ml多克隆抗体纯化（Protein G法）CS0018 ￥1,000 / 20 ml多克隆抗体纯化（抗原特异性纯化法）CS0019 按蛋白得率收费：￥2,000 / 1mg●∙利用Protein G 法纯化多克隆抗体的得率在14 mg 蛋白/ 1 ml 抗血清的水平;●∙利用亲和纯化法纯化多克隆抗体的得率在25 mg 蛋白/ 20 ml 抗血清的水平；●∙选择抗原特异性纯化法的顾客，每纯化20 ml 的抗体，需提供10 mg 抗原。
抗体的制备实验报告
一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。
二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。
抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。
根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。
本实验主要制备多克隆抗体。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。
2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。
3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。
注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。
4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。
5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。
6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。
五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。
2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。
六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。
七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。
2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。
本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。
3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。
4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。
实验二多克隆抗体的制备
摇匀 置 37℃ ℃ 水浴 箱内 15~3 0min
全溶 全溶 全溶 全溶 全溶 大半溶 全不溶
ห้องสมุดไป่ตู้
注意事项： 注意事项： 1.抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确 2.补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜
作业：计算本组的溶血素单位。 作业：计算本组的溶血素单位。
实验二 多克隆抗体的制备
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目的： 目的：掌握溶血素的制备和溶血素单位滴定 的原理和方法。 的原理和方法。 原理：绵羊红细胞（ 原理：绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔后可以 ） 产生抗SRBC的抗体，该抗体能与 的抗体， 结合， 产生抗 的抗体 该抗体能与SRBC结合， 结合 在补体参与下，能使SRBC溶解，此抗体也称 溶解， 在补体参与下，能使 溶解 溶血素， 溶血素，常用于补体结合及补体活性测定等 实验。 实验。
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实验器材： 实验器材： 1.器具： 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、小 器具： 器具 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、 试管、滴管、注射器。 试管、滴管、注射器。 2.材料：家兔、全羊血、20%羊红细胞悬 材料：家兔、全羊血、 材料 羊红细胞悬 液。
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实验方法
1.溶血素的制备 溶血素的制备
最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。 最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。如果达 3d 5000以上时 可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃ 以上时， 4℃保存 到1：5000以上时，可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃保存
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2.溶血素单位滴定法 溶血素单位滴定法
注射日期 1 3 5 7 9 12 15 注射途径 皮内 皮内 皮内 皮内 皮内 静脉 静脉 注射剂量 全羊血0.5ml 全羊血 全羊血1.0ml 全羊血 全羊血1.5ml 全羊血 全羊血2.0ml 全羊血 全羊血2.5ml 全羊血 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞
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实验二多克隆抗体的制备
实验目的和要求：
1、掌握多克隆抗体制备方法
2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定
实验内容：
1、猪链球菌（
2、7、9型）分型血清制备
2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定
实验方法和步骤：
（一）相关免疫血清的制备
2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体
1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组
2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免
3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL
5、分离血清之后，-20℃保存备用
（二）琼脂扩散实验：
材料和试剂
1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液
巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。
2、1%预复琼脂（或琼脂糖）
1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
3、1%琼脂糖凝胶
1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
4、抗原及相应免疫血清。
操作步骤
1．预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
2．凝胶板的制备
溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。
3．免疫扩散及结果观察
将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。
待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。
湿盒于25℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。
4．免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。
（三）标本的保存
为了保存标本，可染色处理，步骤如下：
1用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。
2 浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。
3打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。
4用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。
也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。
实验结果
讨论
参考文献。