兔抗CAP43多克隆抗体制备和初步纯化
兔抗Myosin Ⅹ多克隆抗体的制备及初步应用
兔抗Myosin Ⅹ多克隆抗体的制备及初步应用张建华;施恒亮;翟艳华;俞华莉;曹让娟;朱筱娟【期刊名称】《东北师大学报：自然科学版》【年(卷),期】2012(44)1【摘要】为制备兔抗肌球蛋白Ⅹ(myosinⅩ,MyoⅩ)多克隆抗体,合成了含有MyoⅩN端1 000～1 021个氨基酸的多肽,将纯化后的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin,KLH)进行交联;通过背部皮下免疫新西兰大白兔获得免疫血清,并通过ELISA、免疫印迹、免疫荧光等分析对免疫血清进行了初步的验证.结果表明:经过4次免疫后可获得免疫血清,ELISA检测表明抗体终效价达到1∶51 200,抗原吸附实验进一步证明了此多克隆抗体的特异性.利用获得的多克隆抗体检测了多种组织中MyoⅩ的表达,发现兔抗MyoⅩ多克隆抗体可特异性识别多种组织中的MyoⅩ.免疫荧光染色表明该抗体可以显示MyoⅩ在COS-7细胞、NLT细胞和神经元中的分布.【总页数】5页(P140-144)【关键词】肌球蛋白Ⅹ;多克隆抗体;半抗原【作者】张建华;施恒亮;翟艳华;俞华莉;曹让娟;朱筱娟【作者单位】东北师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用 [J], 刘少伟;姜欢;王晓龙;李梦红;陈玉;唐中元;胡敏2.兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用 [J], 成毅明;刘美玲;石心泉;王介东;贾孟春3.兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定 [J], 杨秉芬;李平;李娟;瞿秀华;李晓明;柳晓兰;孙启鸿;曹诚4.兔抗长爪沙鼠免疫球蛋白G特异性多克隆抗体的制备与应用 [J], 姜慧芬; 陈卓; 徐笑红; 吴宇辰; 郑晓妍; 蔡静; 高孟; 罗永能5.兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化 [J], 何萍;张斯;尹元琴;隋承光;孟凡东;王晓华;张志强;姜又红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种兔抗牛α -酪蛋白多克隆抗体的制备方法[发明专利]
![一种兔抗牛α -酪蛋白多克隆抗体的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b7960b32a58da0116d1749a7.png)
专利名称：一种兔抗牛α -酪蛋白多克隆抗体的制备方法专利类型：发明专利
发明人：王洪荣,庞学燕,季昀,喻礼怀,王梦芝
申请号：CN201210471998.4
申请日：20121120
公开号：CN102977211A
公开日：
20130320
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种兔抗牛α-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，为鉴定奶牛乳腺组织合成的α-酪蛋白提供试验材料。
本发明选用健康新西兰大白兔每两周免疫一次奶牛α-酪蛋白，待抗血清达到效价后，对兔进行颈动脉放血并分离血清，利用饱和硫酸铵法（盐析）结合蛋白A树脂（亲和层析）纯化抗体，分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）法鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。
抗血清经过饱和硫酸铵和蛋白A树脂两步纯化不仅得到了纯度较高的抗体，而且延长了蛋白Ａ树脂的使用寿命，节约了成本。
纯化得到的抗体可以特异性结合奶牛α-酪蛋白，为进一步研究奶牛α-酪蛋白合成的调控提供了有效的科研工具。
申请人：扬州大学
地址：225009 江苏省扬州市大学南路88号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：卢亚丽
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多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。
(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。
用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。
(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。
初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。
(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。
使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。
每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。
9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。
(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。
用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。
用PBS-Tween洗6次。
(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。
兔多克隆抗体的制备流程
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1. 免疫原制备。
选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。
利用合成多肽制备兔多克隆抗体
利用合成多肽制备兔多克隆抗体谭凤彪;高家林;陆晓华;章尧【期刊名称】《皖南医学院学报》【年(卷),期】2016(35)5【摘要】目的:利用人工合成多肽制备载脂蛋白M(appliprotein M,ApoM)兔多克隆抗体.方法:分析并选取一段特异性的ApoM氨基酸序列用于合成多肽,并耦联钥孔血蓝蛋白(KLH),用来免疫雄性的新西兰大白兔,经过多次加强免疫后用收集的兔抗血清制备多克隆抗体,并进行Western Blot检测.结果:利用人工合成并纯化的多肽,经多次免疫后获得所需的多克隆抗体.结论:成功制备了兔ApoM多克隆抗体,为后续的实验研究ApoM的功能提供实验基础.【总页数】4页(P422-425)【作者】谭凤彪;高家林;陆晓华;章尧【作者单位】皖南医学院生物化学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;皖南医学院活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;皖南医学院第一附属医院弋矶山医院内分泌科,安徽芜湖241001;皖南医学院机能学实验中心,安徽芜湖241002;皖南医学院生物化学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.应用合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1多克隆抗体的研究 [J], 赵志刚;邱添;田庆;陈良安;梁志欣2.兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用 [J], 成毅明;刘美玲;石心泉;王介东;贾孟春3.禽胰多肽小脑膜受体多克隆抗体的制备与效价测定研究 [J], 赵成萍;张映4.A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 程凯慧;沈付娆;邹积振;苗自利;解晓莉;张亮;杨宏军;何洪彬5.牛病毒性腹泻病毒离子孔道蛋白p7多肽多克隆抗体的制备和鉴定 [J], 付强;郭妍婷;陈俊贞;王金泉;史慧君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
制备多克隆抗体(2 至 3 个月)
制备多克隆抗体（2 至 3 个月）实验动物：2 只大耳兔；●∙顾客方需提供抗原样品> 5 mg,纯度> 90 %.抗原经SDS-PAGE 检测。
若达不到要求的抗原顾客仍坚持启动项目，风险由顾客承担；●∙多次免疫兔子，每次测定效价（ELISA），数据最后一并提供给顾客；●∙提供最后一次免疫的抗血清20 ml，若量需要增加，收费另外增加；若需要提供免疫前的血清，需预先说明，并相应增加费用￥300，一般提供 1 至 2 ml；●∙验收方式：通过ELISA 方法进行检验；●∙验收标准：制备的多克隆抗体与客户方提供的抗原样品有特异性结合，同时抗体特异性只针对客户方提供的抗原样品做出保证；●∙如需做小鼠或其他动物的多克隆抗体，请与我们联系，收费标准另议。
●∙以上收费仅限于提供兔子抗血清。
最终提供：20 ml兔子的抗血清，效价在1：10，000以上，并给出相应的ELISA 鉴定报告。
制作及运输过程中，抗血清均在-20 ℃保存。
纯化多克隆抗体（1周）纯化方法Cat. No. 价格（人民币）多克隆抗体纯化（饱和硫酸氨法）CS0017 ￥500 / 20 ml多克隆抗体纯化（Protein G法）CS0018 ￥1,000 / 20 ml多克隆抗体纯化（抗原特异性纯化法）CS0019 按蛋白得率收费：￥2,000 / 1mg●∙利用Protein G 法纯化多克隆抗体的得率在14 mg 蛋白/ 1 ml 抗血清的水平;●∙利用亲和纯化法纯化多克隆抗体的得率在25 mg 蛋白/ 20 ml 抗血清的水平；●∙选择抗原特异性纯化法的顾客，每纯化20 ml 的抗体，需提供10 mg 抗原。
多克隆抗体的制备[1]
![多克隆抗体的制备[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/e1ba29e00242a8956bece4b5.png)
多克隆抗体的制备1. 器材：剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿（直径18cm）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
2. 试剂：生理盐水(或PBS)，弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881，弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506，二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN33. 兔子的选择：兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
4. Pre-bleeding：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。
每次免疫的抗原量约100μg。
免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。
因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。
在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。
最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。
免疫兔制备抗体流程
免疫兔制备抗体流程英文回答：Preparation of Antibodies from Immunized Rabbits.Introduction.Antibodies are specialized proteins produced by the immune system in response to exposure to foreign substances, known as antigens. They are essential for recognizing and neutralizing pathogens, such as bacteria and viruses. Immunized rabbits are a common source of antibodies for research and diagnostic purposes.Procedure.1. Immunization.Rabbits are initially immunized with the target antigen. This can be done through various routes, includingsubcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal injection. The antigen is often formulated with an adjuvant, such as Freund's adjuvant, to enhance the immune response.2. Antibody Production.Following immunization, the rabbit's immune system produces antibodies against the specific antigen. These antibodies circulate in the blood and can be collected from serum or plasma.3. Serum Collection.Blood is drawn from the rabbit at regular intervals after immunization. The blood is allowed to clot, and the serum is separated by centrifugation. The serum contains the antibodies produced in response to the antigen.4. Antibody Purification.The antibodies present in the serum are purified using various techniques, such as precipitation, chromatography,or affinity-based methods. Purification removes impurities and concentrates the specific antibodies.5. Characterization.The purified antibodies are characterized to determine their specificity, affinity, and titer. These parameters are assessed using methods like enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or Western blotting.Applications.Antibodies from immunized rabbits have numerous applications in research and diagnostics:Western blotting.Immunohistochemistry.Flow cytometry.Immunoassays.Vaccine development.Advantages of Using Immunized Rabbits.Immunized rabbits provide several advantages for antibody production:High antibody yield.Specificity for the target antigen.Consistent antibody production.Ease of handling and maintenance.中文回答：制备免疫兔抗体流程。
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【摘要】目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。
方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。
结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。
结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。
【关键词】半抗原流行病学和动物实验已证实，镍化合物可以致癌，以致肺癌为主。
为进一步研究Cap43在镍所特异引起肺癌者体内组织及血清中的表达水平及其特点，本实验采用硫化二亚胺(EDC)连接多肽与大分子载体蛋白的方法，使其组成完全抗原，进而免家兔制备抗Cap43多克隆抗体，为研究镍所致肺癌提供依据。
1 材料与方法1 1 材料多肽由上海生工全自动合成仪合成；EDC试剂盒(美国Pierce公司)，完全及不完全福氏佐剂(美国Sigma公司)；HRP-羊抗兔和 DAB (北京中杉金桥生物技术公司)；硝纤维素膜(NC膜)，SephadexTMG-25 脱盐柱(Amersham Biosciences,Sweden),小牛血清，牛血清白蛋白(洛阳华美公司)；loading buffer(北京碧云天生物公司)；其他试均为国产分析纯；日本大耳兔平均体重15kg(本校动物实验中心)。
1 2 方法12 1 Cap43特征性肽段的合成由上海生工合成Cap43 C末端特征性的由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复
3次所组成的肽段。
总质量为10mg，合成后期经HPLC纯化，纯度>95%。
冷冻干燥4℃保存。
12 2 免疫大耳白兔制备抗Cap43抗血清 (1)正式实验之前的动物准备：取5只体重1.5kg的雄性家兔作为免疫动物，同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。
(2)用EDC法将半抗原与载体蛋白(mcKLH)连接成同时具有免疫原性与免疫反应性的大分子量完全抗原，反应过程严格按照EDC试剂盒的说明书进行。
(3)使用脱盐柱脱盐，纯化大分子载体蛋白-多肽连接物：分别用10个15ml的EP管依次收集10管流出液，紫外分光检测波长280nm 处各管的吸光度(A)值，如果在280nm波长处有1个显著的吸收峰，表示连接成功。
(4)将连接好的半抗原-载体蛋白混合物与等体积佐剂的混合，采用常规微量多次免疫法免疫家兔(抗原0.5mg/只)，第1次免疫使用完全福式佐剂，并于4周后进行第2次免疫(第2次及以后使用不完全福氏佐剂)，以后每2周免疫1次，于第5次免疫后1周采耳缘静脉血，间接斑点ELISA法检测抗体的效价，达到一定效价后直视下心脏采血收集血清。
12 3 斑点ELISA法检测抗Cap43多克隆抗体效价取硝酸纤维素膜(NC膜)制成4cm×4cm的方格，浸入01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中10min，室温干燥后，将卵清蛋白(OVA)-半抗原(连接方法与上述半抗原-mcKLH相同)PBS液每格1μl包被NC膜，室温静置1h；2%的牛血清白蛋白溶液封闭，室温振荡1h；0.5%Tween20的PBS液洗3次，室温干燥；加一抗，同时设立阴性对照即免疫前小兔的血清，其与一抗稀释度相同，空白对照即0.01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，每格1μl,室温静置1h后用洗涤液洗3次，室温干燥；加酶标二抗每格1μl,室温静置0.5h后用洗涤液洗3次，5min/次，室温干燥；每格加入适量底物DAB显色液，避光显色5～10min，蒸馏水冲洗中止反应，目测观察〔1〕。
[!--empirenews.page--] 12 4 辛酸-硫酸铵法纯化抗体取需纯化的血清用60mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液稀释4倍(01mol/L的HCl调pH4.5)；于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的血清体积加75μl,4℃静置2h，15000r/min离心30min,弃沉淀；上清滤纸过滤后加1/10体积的pH7.4，01mol/L PBS(用1mol/L的NaOH调pH至7.4)；在4℃冰浴下于30min内加入0277g/ml硫酸铵，使成45%饱和度，4℃静置过夜，12000r/min，离心30min，弃上清；沉淀溶于适量001mol/L、pH7.4的PBS中，用PD10柱过滤，收集流出液，无菌过滤分装，-20℃保存备用。
12 5 (SDS-PAGE)电泳考马斯蓝检测体抗体纯度采用12%SDS-PAGE 电泳检测抗体纯度，将电泳完后的凝胶放于溶解了0.25g考马斯亮蓝R250的甲醇、水、冰乙酸组成的染色液中室温过夜，之后放于脱
色液中脱色，直至凝胶底色脱为无色为止，观察染色条带。
2 结果2 1 半抗原-载体蛋白连结后的A值(图1) 从图1可见，峰值在4，5管，此时收集第4，5管即峰值所在管中的溶液。
图1 半抗原—载体蛋白连接实验后的A值（略）2 2 斑点ELISA结果观察221斑点ELISA实验条件的选择 (1)最适抗原和酶标二抗浓度的选择：测定结果为抗原为1：20，酶标二抗浓度为1：320；(2)最适室温选择：室温下1h的效果较4℃过夜效果要好；(3)最佳封闭条件：采用2%牛血清白蛋白001mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液闭效果较好；(4)振荡对反应的影响：振荡可加快抗原抗体反应速度，与在振荡条件下封闭0.5h的效果相同；(5)血清灭活：阴性血清经灭活56℃灭活补体后假阳性反应减少。
2
2 2 斑点ELISA结果(图2) 经目测，阳性反应为棕红色斑点，阳性显色>阴性>空白，并且斑点颜色的深浅随血清抗体滴度的升高而变浅。
最终实验结果为，兔抗Cap43多克隆抗体效价为1∶500。
2
3 SDS-PAGE电泳考马斯蓝鉴定的抗体纯度(图3) 根据蛋白分子Marker标记，纯化后的第3条带为抗体所在位置。
图2 斑点ELISA检测兔抗Cap43多克隆抗体效价（略）图3 SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝鉴定初步纯化后的兔抗Cap43抗体纯度（略） 3 讨论研究发现，Cap43除了有磷酸化位点外，它没有跨膜转运区域或是锌指结构以及金属结合区，但在其C末端由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复3次组成的特征性序列上可能有镍结合位点〔2〕。
pH计分光镜分析表明，其中的20个氨基酸残基(定为肽段1)可以结合1到2个金属离子，而30个氨基酸(定为肽段2)可以结合1个、2个或3个金属离子。
分析生理条件下金属离子与其配基的比例发现，不管是肽段1还是2可结合镍的金属离子都与其肽段中的组氨酸残基的咪唑氮原子的数量相对应。
在pH8～9之间可以形成八面体结构，在pH9以上可以形成平面4N的结构。
同时在Cap43启动子上有1个HIF-1结合位点，在3′末端非翻译区有2个HIF-1结合位点，其中1个是调节转录的。
研究表明，在镍化合物及缺氧应激因素同时存在时，可引起Cap43更高的表达；在镍及缺氧在缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)敲除的细胞系中则丧失了诱导Cap43表达的能力〔3-5〕。
由此可见，肿瘤(缺氧)-镍化合物(镍)-Cap43之间一定存在某种关系。
[!--empirenews.page--] 为研究Cap43在镍所特异引起的肺癌中的分子生物学发生机制，采用碳化二亚胺EDC化学偶联试剂盒连接合成的Cap43末端特征性的30个氨基酸组成的多肽组成的半抗原和大分子载体蛋白钥孔血蓝蛋白mcKLH制备成完全抗原(多肽-mcKLH),使其同时具有免疫原性与免疫反应性，以其免疫家兔，经11周多次微量免疫后获得兔抗Cap43多克隆抗体；采用斑点ELISA法检测抗体效价，避免了抗原用量多与半抗原不好包被96孔板的缺点，之后经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体，辛酸-硫酸铵法方法简便，一般实验人员容易掌握，同时仅需冷冻高速离心机这一实验仪器，它既可用于小样品的纯化也可用于大样品的纯化，提取的IgG纯度高，收率好，且不破坏抗体的免疫功能。
Cap43抗体的制备及初步纯化将有助于今后进一步研究工作。