成年家兔制备多克隆抗体技术

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人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

ｎａｔｈｍａＣＲ１ａｄｐｅａａｉｎｏｔｏｙｌｎｌａｔｄｎｕｎｓｎｒｐｒｔｏｆｉｓｐｌｃｏａｎｉｂｏｙ
ＷＡＮＧａｇｌｎ，ＧＯＮＧｉｃ，ＬＵ —ｉＧｕｎ —ａＣｕ —ｕｉＩＹａｌ，ＺＨＡＮＧＣｈａｇｙａＬＩＳａｎ — ｕｎ，Ｕｈｎ，ＷＡＮＧＷｅ —ｉｎｌ，
ＤＩｉｕＡ — Ｑｙ
（ｅｔａｏａｏｙＭｅｉｎｉａｏｍａｄＰＡ１３Ｈｓｉｌｈｎｚｏ５０２，ｈｎ）ＣｎｅＬｂｒｔｒｒｄｃｅｏｎｎＣｍｎ，Ｌ５ｏｐｔｅｇｈｕ４０４ＣｉａｉｆＪａＺ
摘要：目的：核表达人ｓＲ原Ｃ１分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总ＲＡ进行Ｒ —ＣＮＴＰＲ扩增合成ｃＮ以ｃＮ为模板，建重组表达质粒ｐＴ８ — Ｃ１ＤＡ，ＤＡ构Ｅ２ａｓＲ。转化大肠杆菌中，ＩＴ用ＰＧ诱导表达重组人ｓＲＣ１融合蛋白，其作为免疫原制备兔多抗。采用ＥＩＡ法检测抗体效价，免疫亲和层析法纯化后，将ＬＳ经进行ＳＳＰＧＤ —ＡＥ鉴定分析。结果：原核细胞巾高效表达人ｓＲ在Ｃ１融合蛋白，纯化复性后作为免疫原，疫经免家兔，得了高效价及特异性的兔抗人ｓＲ获Ｃ１多克隆抗体，特异地识别人ｓＲ可Ｃ１蛋白。结论：化复性后纯的ｓＲＣＩ融合蛋白作为抗原免疫家兔，较好的抗原性和免疫原性，功地制备出兔抗人ｓＲ有成Ｃ１多克隆抗体，为进一步大量表达纯化人ｓＲＣ１融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立，为深入研究ｓＲ生物学功能奠也Ｃ１

抗体制备方法

第1章　抗体制备技术抗体（antibody，Ab）是机体B淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。

机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。

由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。

在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。

本章主要介绍这两种抗体的制备方法。

实验一　多克隆抗体的制备多克隆抗体（polyclonal antibody）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。

是用制备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下，该动物体内多个B细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。

含有这些特异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。

一、抗体制备的流程优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。

因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。

（一）免疫动物的选择免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。

选择动物要依据抗体制备的条件而定。

1．抗原与动物的种系　抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。

如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。

2．动物的个体状况　动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。

多克隆抗体的制备

改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；
引起或增强迟发性超敏反应。
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佐剂的作用机制
佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：
可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。
佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。
该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
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特异性鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。
纯度鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。
后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。
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佐剂与抗原混合乳化的方法：
研磨法搅拌混合法
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佐剂的免疫生物学作用
增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；
增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；
白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素 (CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

关键词：卵巢癌；抗体；制备；基因，ＫｉＳｓ＿１ＤＯＩ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１６７３ — ４１３０．２０１３．２１．００７文献标识码：Ａ文章编号：１６７３ — ４１３０（２０１３）２１－２８０３－０３
ｂｌｏｔ及免疫组织化学法检测抗体。结果
成功构建了ＫＩＳＳ－１原核表达载体ｐＥＴ２８／ＫＩＳＳ－１，高效表达并纯化ＫＩＳＳ－１蛋白，间接成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人ＫＩＳＳ－１抗体，为进一步探讨
ＥＬＩＳＡ检测所制备抗体的效价为１：６４００。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定制备的抗体与ＫＩＳＳ－１蛋白能特畀性结合，免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然ＫＩＳＳ－１。结论ＫｉＳＳ－１在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础。
刘晓峰，陈雪礼，涂艳
（九江市第一人民医院／南昌大学附属九江医院检验科，江西九江３３２０００）
摘要：目的制备兔抗人ＫＩＳＳ－１多克隆抗体。方法聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增出ＫＩＳＳ－１基因，将其克隆入原核表达载

磺胺甲恶唑抗原合成及其抗体的制备

隆抗体效价迭１：０，接酶联免疫吸附试１间
磺胺甲嚼唑、氏完全佐剂（ｏｐｅｅＦｅｎ ’ 弗ｃｍｌｒｕｄｓｔ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
验建立的ＳＭＺ检测的线性范围在０１ｎ／．ｇｍＬ１ｇｍＬ之间，０抑制率检测限为￣０／５
沈红，国娟，焕荣吴李
（京农学院动物科学系，京１２０）北北０２６
中圈分类号：８９２￥５．
文献标识码：Ａ
文章编号：０７５３（０６０－０２０１０－０８２０）１０７－４
摘要：用重氮化法将磺胺甲噫唑（ＭＺ将磺胺甲嗯唑与人血清白蛋白偶联制备免疫原，采Ｓ）用与人血清白蛋白偶联形成免疫原，疫大白免合成的免疫原免疫家兔制备多克隆抗体并对其鉴
（以载体蛋白含量计算）ＨＡＳＳ－ＭＺ全抗原，加入等
长，耗资大，对人员要求高，不适合大量样品的筛选量弗氏完全佐剂，分乳化后，皮下注射４只体重充经测定［。酶联免疫吸附试验（ＬＳ作为一种快为２ｋ１ＥＩＡ）ｇ的健康新西兰大白兔，．Ｌ只，周后以０８ｍ／２速、特异和灵敏度较高的免疫测定技术，正逐步应用等量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，
维普资讯
动物医学进展．０６２（）７ —５２０，７１：２７
ＰｒｇｅｓｉｔｒｎｒｅｉｉｅｏｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｄｃｎ

9、多克隆抗体的制备

豚鼠由心脏穿刺采血家兔可以从心脏采血或颈静脉、颈动脉放血，少量采血可通过耳静脉采取马由颈动脉或颈静脉放血羊可以从颈静脉采血或颈动脉、颈静脉放血家禽可以心脏穿刺采血或颈动脉放血
（二）血清的分离

采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固，在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次日离心收集血清。采血量大时，用自然凝固加压法无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体（高免血清）制备技术

一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛奶抗体等

高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗血清（antiserum）分为抗病血清和抗毒素

产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物连续生产的优点。有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。

七、血液采集与血清提取

按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验（试血），血清效价达到合格标准时，即可采血。

不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。
（一）采血次数和方法

效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。

采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血脂过高。

兔抗制备方法

1. 取2 ml 的弗氏完全佐剂加到2 ml 的溶于PBS的纯化抗原中，使之乳化。

用3 ml 注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。

2. 将兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的颈背部毛皮，另一只手托住兔的后腿及臀部，将兔束紧固定以使后肢不能伸张，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，在后肢大腿肌肉内进针约1 cm 深，毎条大腿肌肉内最多注射0.5 ml 乳化液。

3. 四周后，用1 mg 的混溶干弗氏不完全佐剂的抗原乳化液（1：1）对兔进行肌肉内加强免疫注射，操作步骤同1和2，初次加强免疫后2周再次进行加強免疫注射。

4. 第二次加强免疫注射10天后，从兔的耳缘静脉处放血。

（1）先将兔固定在固定架上（固定紧），使其耳朵伸出，用70%乙醇洗洁消毒一侧耳朵。

（2）将兔耳置于热灯之下，用手指轻轻地拍打兔耳；1~2 min 内兔耳上的血管即会充分地充盈。

（3）用一消毒过的解剖刀的锋尖在兔耳缘静脉上迅速划一长约0.5 cm 的小口，收集兔血于50 ml 的塑料离心管中，直至伤口不再流血为止。

（4）使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。

5. 将兔耳擦拭干净，涂以70%乙醇，在耳朵伤口上涂一层凡士林，以减轻由乙醇产生的皮肤刺激感。

6. 将兔血在室温下静置数小时后置4 ℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻地挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血洧移到合适的离心管中，5 000 g 离心10 min，去除残留的红细胞及其他碎片。

7. 每两星期进行进一步的加强免疫。

每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。

8. 采用ELISA法或RIA法对血清中的特异性抗体进行滴度测定。

如果需要的话。

1. 按基本方案中步骤1制备免疫兔用的抗原。

2. 牢牢地抓住兔子，剃除其背毛，用70%乙酵消毒其暴露的皮肤。

用拇指和食指将需要免疫注射的区域的皮肤张开，用3 ml 注射器带24G注射针头以相对皮肤30。

多克隆抗体制备的技术_PPT幻灯片

• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•
电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天左右的间隔时间。
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，

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在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。

机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。

本技术专题介绍以成年家兔制备多克隆抗体
一、实验原理
当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

二、实验材料
1. 实验动物
成年兔。

2. 实验器材
特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

3. 实验试剂
(1) 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

(2) 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：
福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分
（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）
三、实验步骤
(一) 抗原的制备
抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。

(二) 预放血
轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。

按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。

结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。

取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C 放置过夜使血液凝固。

用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。

(三) 注射抗原
(2) 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。

将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。

待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。

(四) 收集血液
(1) 将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。

用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。

收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。

(2) 将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。

用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。

(五) 结果检测
生物科研提醒：
1. 抗Ig的效价测定：琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。

2. 纯度鉴定：采用琼扩法。

中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。

在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。