人Calnexin基因慢病毒载体及稳定表达Calnexin蛋白的宫颈癌细胞株构建
生物免疫学英文词汇学习---
医学免疫学英中文词汇Aaccessibility易接近性acetylcholine，Ach 乙酰胆碱acquired immune deficiency syndrome，AIDS获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)acquired tolerance 获得性免疫耐受activation-induced cell death，AICD，活化诱导的细胞凋亡active immunotherapy主动免疫疗法acute phase protein，APP急性期蛋白acute rejection急性排斥反应acute vascular rejection，AVR急性血管性排斥adaptive immune system适应性免疫系统adaptive immunity 适应性免疫adenosine deaminase，ADA腺苷脱氨酶adhesion molecule，AM黏附分子adjuvant佐剂adoptive immunity过继免疫adult thymectomy，AT成年胸腺切除术affinity亲和力affinitymaturation(抗体)亲和力成熟agglutination凝集反应alkalinephosphatase，AP碱性磷酸酶allergen变应原allergicinflammation，AI变态反应炎症alloantigen同种异型抗原allograft同种异基因移植allotype同种异型alpha-fetoprotein，√廿P甲胎球蛋白alternative pathway旁路(替代)途径anaphylatoxin过敏毒素anaphylaxis过敏反应ankylosingspondylitis，AS强直性脊柱炎antibody dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用antibody，Ab抗体，antigenpresentation抗原提呈antigen presentingcell，APC抗原提呈细胞,antigen，Ag抗原,antigen-bindingfragment，Fab抗原结合片段,antigen-binding site抗原结合部位,antigenicdeterminant，AD抗原决定簇antigenic valence抗原结合价,antigenicity抗原性,anti-idiotype，Aid抗独特型anti—infectionimmunity抗感染免疫antiserum抗血清antitoxin抗毒素apoptosis细胞凋亡artificial activeimmunization人工主动免疫artificial antigen人工抗原artificial passiveimmunization人工被动免疫ataxia telangiectasia，AT 毛细血管扩张性共济失调综合征atopy特应性attenuated vaccine减毒活疫苗autoantigen 自身抗原autograft 自体移植autoimmunedisease 自身免疫病autoimmunity自身免疫avidin亲和素(抗生物素蛋白)avidity亲合力azoprotein偶氮蛋白Bp barrel p桶状p lysin乙型溶素B cell receptor，BCR B细胞受体basophil嗜碱粒细胞Bence-Jones protem 本周蛋白bbfunction anibody，B{Ab双功能抗体Bioinformaties生物信息学biological response modifier，BRM 生物应答调节剂biotin生物素,biotin-avidin system，BAS生物素一亲和素系统bi-specific antibody，BsAb双特异抗体bone marrow骨髓bovine gamma globulin，BGG牛丙种球蛋白bradykinin缓激肽bursa of Fabricius法氏囊bursa or bonemarfow dependentlymphocyte法氏囊或骨髓依赖的淋巴细胞(B细胞)CC reaction protein，CRP C反应蛋白C1 inhibitor，C1INHC1抑制物C3b inactivator C3b灭活因子(I因子)CA binding protein，CAbp CA结合蛋白Cadherin钙黏蛋白Calnexin钙联蛋白carcinoembryonicantigen，CEA癌胚抗原carrier载体carrier effect载体效应Caspase半胱天冬蛋白酶CD40 ligand，CD40LCIM0配体cell surface marker细胞表面标记cellular rejection细胞性排斥反应central immuneorgan中枢免疫器官central tolerance中枢耐受centroblast生发中心母细胞chemokine趋化因子chemotaxis趋化性chimeric antibody嵌合抗体chronic rejection慢性排斥反应class 11-associatedinvariant chainpeptide，CLIP Ⅱ类相关的恒定链肽段classical pathway经典途径clonal anergy克隆无能clonal deletion克隆清除clonal selectiontheory克隆选择学说cluster ofdifferentiation，CD分化群codominance共显性collagen，CA胶原蛋白colony forming unit-culture，CFU-C体外培养集落形成单位colony forming unit-spleen，CFU-S 脾集落形成单位colony stimulatingfactor，CSF集落刺激因子committed stem cell定向干细胞common antigen共同抗原complementdependentcytotoxicity，CDC补体依赖的细胞毒complementreceptor，CR补体受体complement system补体系统complement，C补体complementaritydetermining region，CDR互补决定区complete antigen完全抗原concanavalin A，ConA刀豆蛋白Aconformational determinant构象决定簇conjugate vaccine结合疫苗constant region，C 区恒定区Coombs test抗球蛋白试验coreceptor共受体cortex皮质区co-stimulatory molecule receptor，CMR 协同刺激分子受体co-stimulatory molecule，CM协同刺激分子cross-reaction交叉反应crystallizable fragment，Fe可结晶片段CTL antigen-4，Cn。
慢病毒载体的构建
慢
慢病毒载体是一种常用的基因转移工具，其安全性评估主要 包括对病毒的毒力、致病性和传播性的评估。在构建慢病毒 载体时，应确保所选用的慢病毒毒株无致病性，且不具有传 播性。
慢病毒载体的生物安全性
在构建慢病毒载体时，应确保载体无外源污染，如细菌、真 菌、支原体等污染。同时，应进行逆转录酶活性检测，以确 保载体无逆转录酶活性，从而避免潜在的基因重组和插入突 变风险。
慢病毒载体的构建流程
01
02
03
04
目的基因的克隆
将目的基因克隆到慢病毒载体 中，常用的克隆方法包括限制
性酶切、连接和转化等。
慢病毒载体的包装
将目的基因与包装信号共同转 染包装细胞，包装细胞能够产 生具有感染力的慢病毒颗粒。
慢病毒的纯化
通过离心、过滤等方法将慢病 毒颗粒从包装细胞中分离出来
，并进行纯化。
生物学功能分析
对目的基因进行生物学功能分析， 如报告基因实验、细胞活性实验、 动物模型实验等，以评估慢病毒 载体对目的基因功能的改善效果。
安全性评估
对慢病毒载体进行安全性评估， 包括对宿主细胞的毒性、免疫反 应、致瘤性等方面进行检测，以 确保慢病毒载体的应用安全可靠。
05
慢病毒载体的安全性与伦理问题
慢病毒的滴度测定
测定纯化后慢病毒的滴度，即 每毫升或每毫克病毒颗粒的数
量。
02
慢病毒载体的设计
包装元件的选择
01
02
03
包装元件
选择合适的包装元件是构 建慢病毒载体的关键步骤， 包括病毒的复制酶、转录 酶和整合酶等。
安全性
确保所选的包装元件无致 病性，不会对宿主细胞造 成不良影响。
兼容性
确保所选的包装元件与载 体的其他元件兼容，能够 实现有效转导和表达。
慢病毒介导stathmin_1基_省略_宫颈hela细胞p53蛋白的影响_孔守芳
论 著 246
1 材料与方法
1．1 实验材料 人宫颈癌 Hela 细 胞株受赠于 青岛大学医 学 院
病源学实验室。 DMEM 完全培养基购自美国 Gibco 公 司 ，HyClone 小 牛 血 清 购 自 北 京 方 程 生 物 有 限 公 司。 STMN-1 引物及小发夹 shRNA 片段均由上海吉 凯基因化学 技术有限公 司合成， 慢 病毒 GV115 载 体、AgeⅠ、EcoRⅠ酶， 购自上海吉凯基因化学技术 有 限 公 司 。 Lipofectamine 2000、Trizol 试 剂 盒 购 自 Invitrogen 公 司 ， 胰 酶 、 噻 唑 蓝 （MTT）、 二 甲 基 亚 砜 （DMSO）购自上海生物试剂厂，p53 小鼠抗人单克隆 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 Hela 细胞中 STMN-1 表达丰度测定
摘 要 ：［目 的 ］ 研 究 宫 颈 癌 Hela 细 胞 中 Stathmin-1 表 达 对 p53 蛋 白 的 影 响 及 对 细 胞 增 殖 的 作 用 。 ［方 法 ］ 构 建 Stathmin-1 siRNA 慢 病 毒 载 体 ，包 装 重 组 慢 病 毒 ，感 染 宫 颈 癌 Hela 细 胞 株， 沉默 Stathmin-1 表达为干扰组， 采用导入阴性片段的慢病毒感染 Hela 细胞作为对照组。 MTT 法检测细胞增殖，蛋白印迹法（Western-blot）检测细胞 p53 蛋白的表达。 ［结果］ 感染重组 慢 病 毒 及 阴 性 病 毒 后 ，Stathmin-1 基 因 干 扰 组 Hela 细 胞 增 殖 24h 后 较 对 照 组 抑 制 明 显 （P< 0.05）。 与对照组相比，干扰组中 p53 蛋白表达明显减少（P<0.05）。 ［结论］ 宫颈癌 Hela 细胞中 Stathmin-1 影响 p53 蛋白表达，沉默 Stathmin-1 可抑制细胞增殖。 关键词：Stathmin-1；p53 蛋白；Hela 细胞；慢病毒；细胞增殖 中图分类号：R737.33 文献标识码：A 文章编号：1004-0242（2015）03-0246-04 doi：10.11735/j.issn.1004-0242.2015.03.A016
HRAS基因表达对宫颈癌细胞自噬及凋亡作用及机制
HRAS基因表达对宫颈癌细胞自噬及凋亡作用及机制作者：阎臻付晓瑞李新敏崔珺来源：《青岛大学学报（医学版）》2021年第02期[摘要]目的探討Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）表达对宫颈癌细胞自噬及凋亡的作用及其机制。
方法构建宫颈癌小鼠模型，苏木精-伊红（HE）染色验证小鼠模型构建是否成功。
将宫颈癌Hela细胞分为4组，空白对照组（A组：不转染任何序列）、阴性对照组（B 组：转染空载体质粒）、HRASvector组（C组：转染HRAS过表达质粒）、si-HRAS组（D 组：转染HRAS沉默质粒siRNA）。
实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分别检测宫颈癌组织和细胞中HRAS、磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）、自噬相关基因7（ATG7）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin1、BCL2关联X蛋白（bax）、TNF受体超家族成员6（Fas）和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平，流式细胞术检测转染各组细胞凋亡情况。
结果 HE染色结果显示宫颈癌小鼠造模成功。
宫颈癌小鼠模型中HRAS呈高表达，PTEN表达下调（t=9.450～14.260，P<0.05）。
细胞转染后HRASvector组HRAS、bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平明显上升，PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin均呈低表达，细胞凋亡率明显下降（F=1.011～220.400，P<0.05）;而si-HRAS组趋势相反（F=3.160～622.800，P<0.05）。
结论 HRAS基因表达下调可能通过激活PTEN信号通路促进小鼠宫颈癌细胞自噬和凋亡，抑制上皮间质转化，从而抑制宫颈癌的发生。
[关键词]基因，ras;宫颈肿瘤;自噬性细胞死亡;细胞凋亡;PTEN信号通路[中图分类号]R394.2;R737.33[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2021）02-0240-06[ABSTRACT]Objective To investigate the role and mechanism of V-Ha-Ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog （HRAS） gene expression in the autophagy and apoptosis of cervical cancer cells.Methods A mouse model of cervical cancer was established， and HE staining was used to verify whether this model was successfully established. Cervical cancer Hela cells were divided into blank control group （no transfection of any sequences）， negative control group （transfection with empty vector plasmid）， HRAS vector group （transfection with HRAS overexpression plasmid）， and si-HRAS group （transfection with HRAS-silencing plasmid siRNA）. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of HRAS， phosphatase and tensin homolog （PTEN）， autophagy-related gene 7 （ATG7）， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， Beclin1， Bcl2-associated X protein （bax）， tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 （Fas）， and E-cadherin in cervical cancer tissue and cells， and flow cytometry was used to observe apoptosis in each group. Results HE staining showed that the mouse model of cervical cancer was successfully established. HRAS was highly expressed and PTEN expression was downregulated in the mouse model of cervical cancer （t=9.450-14.260，P<0.05）. After transfection， the HRAS vector group had significant increases in the mRNA and protein expression of HRAS and Bcl-2， low expression of PTEN，ATG7， LC3， Beclin1， bax， Fas， and E-cadherin， and a significant reduction in cell apoptotic rate （F=1.011-220.400，P<0.05）， while the si-HRAS group showed opposite trends （F=3.160-622.800，P<0.05）.Conclusion By activating the PTEN signaling pathway，downregulation of the HRAS gene may promote the autophagy and apoptosis of cervical cancer cells in mice， inhibit epithelial-mesenchymal transformation， and thus inhibit the development of cervical cancer.[KEY WORDS]genes， ras; uterine cervical neoplasms; autophagic cell death; apoptosis; PTEN signaling pathway宫颈癌是与乳癌具有相似病死率的妇科恶性肿瘤，严重危害女性生活质量[1]。
内质网内的泛素化机制
内质网内的泛素化机制当蛋白质经过内质网（endoplasmic reticulum，ER）的时候，会有一套―质控‖系统暂时将那些新合成的蛋白质―扣留‖下来，帮助它们成熟。
只有折叠正确的蛋白质才会被―释放‖，而那些不能成熟的蛋白质则会被继续―关押‖，但是这样会损害内质网的功能。
因此，为了维持内环境的稳态，蛋白质质控系统会将这些―不合格产品‖移交到胞质溶胶当中，在那里，被蛋白酶体降解掉。
随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象，我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。
在所有人类基因组编码的蛋白质当中，大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。
这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理，这些目的地广泛分布在细胞各种，例如细胞膜上，各种胞内或胞外的腔室（Exocytotic and endocytotic compartments），以及细胞外表面等等。
内质网不仅仅只是提供了一个―容器‖，它同时还提供了众多的分子伴侣，帮助蛋白质折叠、成熟。
不过虽然细胞提供了这些帮助，蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。
大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。
这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误，或者各个亚基之间的合成不平衡，从而不能形成正确的构象而被降解的。
即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。
这些损伤蛋白会聚集在一起，也会出现功能障碍，这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。
因此，进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能，这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控，维持内质网的完好性。
在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖（N-linked glycan structure）结构被保护起来，可以免遭降解。
随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种―聚糖密码（glycan code）‖所标记（图1）。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》)（大肠杆菌-80℃保存2—3年，质粒—20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）(1)载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2)：包含了pol、gag包装成分(3)包膜质粒（pMD2。
G)：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂:XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装),一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂(配好后4℃保存,原材料室温保存）:5X PEG8000/NaCl溶液(聚乙二醇)：NaCl 8.766 g；PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中,高压蒸汽灭菌*＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天)：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（—20℃分装保存)：溴化己二甲铵.是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2~10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞(复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一〉病毒包装与收集(中皿,转染步骤类似于瞬转)第一天1、种板,10×105个293T细胞,加入全培养基双抗DMEM 4—5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min;保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00和17：00各收取一次5ml培养液,共20ml（-80℃保存)2、过滤:用孔径为0。
人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定
人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定杨娅楠;王媛;左志宇;王鑫廷;杨洁【摘要】Objective:To construct human GRP94 gene lentiviral vector and screen the Hela cell line stably expressing GRP94 protein,to provide a cell line model for the study of GRP94 gene regulation in cervicalcancer.Methods:The GRP94 gene fragment was amplified from HeLa cells by RT-PCR and ligated into lentiviral vector expression plasmid pLVx-IRES-Puro to obtain recombinant lentiviralvector pLVx-FLAG-GRP94.After transfection of 293T cells with pLVx-FLAG-GRP94 for 48 h,the expression of FLAG-GRP94 fusion protein was detected by Western blot.PLVX-FLAG-GRP94 recombinant plasmid was co-transfected with 293T cells to obtain recombinant lentivirus carrying FLAG-GRP94.The expression of FLAG-GRP94 protein in 293T cells transtected with recombinant plasmid was detected by Western blot.The GRP94-binding protein lysate was obtained by FLAG-small peptide elution using HeLa cell line which could stably express FLAG-GRP94.SDS-PAGE electrophoresis and silver staining were performed to select the binding protein.Results:Recombinant lentiviral vector was identified by restriction enzyme digestion and gene sequencing.The expression of GRP94 protein in transfected 293T cells was higher than that in wild type HeLa cells (P ＜0.01).The expression of GRP94 protein in HeLa ceils was significantly higher than that in wild-type HeLa cells (P＜0.01).The SND1 protein,which was closely related to tumordevelopment and progression,was successfully detected by mass spectrometry and verified by immnoprecipitation.Conclusion:The GRP94 gene lentiviral vector pLVx-FLAG-GRP94 could be successfully constructed,and the HeLa cell line stably expressing GRP94 protein is screened,which lays a foundation for further study of the mechanism of tumorigenesis and development.%目的:构建人葡萄糖调节蛋白94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型.方法:采用RT-PCR法从HeLa 细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,获得重组载体.瞬时转染293T细胞,采用Western blot法检测GRP94蛋白表达量.pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒.以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株.用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证.结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确.HeLa细胞经慢病毒感染、药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P＜0.01).成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白.结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVx-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2017(023)004【总页数】6页(P290-294,319)【关键词】葡萄糖调节蛋白94;慢病毒载体;HeLa;SND1【作者】杨娅楠;王媛;左志宇;王鑫廷;杨洁【作者单位】天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein，GRP94)是一种分子伴侣，主要贮存在内质网中，参与内质网的应激反应，是内质网应激反应中的重要因子[1-2]。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂１、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》)(大肠杆菌-８０℃保存2－3年,质粒－20℃保存2-3年,病毒液－８０℃保存1年)(1)载体质粒:两端得LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于eｎv序列中得RRE,含宿主RＮA聚合酶识别部分(2)包装质粒(psPAX2):包含了pol、ｇag包装成分(3)包膜质粒(pMD２、Ｇ):用其她病毒得包膜蛋白代替了env基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞:2９3T细胞3、菌株:大肠杆菌,用于提取质粒4、转染试剂:XTＲEＭE—GENE(-20℃保存,不可分装),一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂(配好后4℃保存,原材料室温保存):5X PEＧ8000/NaCl溶液(聚乙二醇):ＮaCl 8、7６6g;PEG８00050g溶解在2００ml Milli－Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊*也可直接从公司买来病毒液(—8０℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存3天):滴度一般为１08ＴU／mｌ6、10mｇ/mｌpolybrene(-2０℃分装保存):溴化己二甲铵、就是带正电得小分子,与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏlｙｂrene 能提高感染效率2~10 倍。
有一定细胞毒性,需要摸索浓度(1～1０μｇ/ｍl)７、无血清培养基:optiｍｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、pｕroｍｙcin:嘌呤霉素,用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一〉病毒包装与收集(中皿,转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,１0×1０5个293Ｔ细胞,加入全培养基双抗DMEM 4-5ｍl,过夜２、配制5X PEG80０0/ＮaＣl溶液称取ＮaCl 8。
766 g; ＰＥG8００0 50ｇ溶解在200ml Ｍilli－Q纯水中;１2１摄氏度30ｍｉn 湿热灭绝 30min;保存在４℃第二天Ａ+B混合室温静置２0miｎ2、加入2ml全培养基DMEM3、将１加入2,孵育10ｈ,换成5ｍl全培养基第四天第五天:１、9:00与17:0０各收取一次5ml培养液,共20ml(—80℃保存)2、过滤:用孔径为0、45mｍ得过滤器除去上清中得293Ｔ细胞3、加入5ml 5XPＥG8０00／NaCl溶液,每30ｍin－1ｈ上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃,3５0０rpｍ,20min2、弃上清,倒扣纸上静置１-2mｉn,吸干残余液体3、加入120－150μl PBＳ,缓慢吹打,以防形成气溶胶4、50μl分装,－80℃保存。
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： 关键词Ｃａｌｎｅｘｉｎ 基因；慢病毒载体；宫颈癌细胞；Ｈｅｌａ 细胞
： ｄｏｉ １０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００２２６６Ｘ． ２０１８． ３５． ０１１
； ： （ ） 中图分类号： 文献标志码： 文章编号
Ｑ５９１． ２ Ｑ７８４
Ａ
１００２２６６Ｘ ２０１８ ３５００４６０４
出稳定表达 蛋白的 细胞，采用 法、 法检测该细胞内的 蛋 ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ
Ｈｅｌａ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｃａｌｎｅｘｉｎ
白及ｍＲＮＡ。结果 构建完成的重组质粒经菌落ＰＣＲ、重组质粒的双酶切、质粒ＰＣＲ 验证后，条带位置对应片段
大小与目的基因大小一致，且经质粒测序后与Ｃａｌｎｅｘｉｎ 基因片段比对一致。经过慢病毒感染、药物筛选后得到的
ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌ ｃＤＮＡ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐＬＶＸＩＲＥＳｐｕｒｏ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐＬＶＸＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ． Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＬＶＸＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ ｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗｅｒｅ ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ ｇｅｎｅ
， ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｈｅｐａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ２４ ｈ １． ０ μｇ ／ ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ， ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｉｅｖｅ ｗａｓ ｆｏｒ ４８ ｈ． Ｆｉｎａｌｌｙ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃａｌｎｅｘ
ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ 基因片段，连接到慢病毒载体ｐＬＶＸＩＲＥＳｐｕｒｏ 中，得到重组慢病毒ｐＬＶＸＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ 质粒。将
慢病毒包装质粒与ｐＬＶＸＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ 重组质粒共转染到人肾上皮２９３Ｔ 细胞中，获得携带ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ 基因序
列的重组慢病毒。将慢病毒感染Ｈｅｌａ 细胞２４ ｈ，在细胞培养基中加入１． ０ μｇ／ ｍＬ 嘌呤霉素，药筛４８ ｈ。最后筛选
讨Ｃａｌｎｅｘｉｎ 基因对宫颈癌潜在的调控作用提供细胞模型。方法 采用ＴＲＩｚｏｌ 提取宫颈癌细胞Ｈｅｌａ 细胞株总
， ＲＮＡ ＲＴＰＣＲ 法逆转录出含有目的基因Ｃａｌｎｅｘｉｎ 的ｃＤＮＡ 序列；根据Ｃａｌｎｅｘｉｎ 的ｃＤＮＡ 序列，选择ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１
限制性酶切位点作为目的位点，设计ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ 基因的ＰＣＲ 引物；利用ＰＣＲ 法从Ｈｅｌａ 细胞ｃＤＮＡ 中扩增出
山东医药２０１８ 年第５８ 卷第３５ 期
·基础研究·
Ｃ人ａｌｎＣｅａｘｌｉｎｎｅｘ蛋ｉｎ白基的因宫慢颈病癌毒细载胞体株及构稳建定表达
李宏帅，王鑫廷，王媛，杨洁 （天津医科大学，天津３０００７０）
摘要：目的 构建人Ｃａｌｎｅｘｉｎ 基因慢病毒载体及稳定表达Ｃａｌｎｅｘｉｎ 蛋白的人宫颈癌Ｈｅ胞中的Ｃａｌｎｅｘｉｎ 蛋白及ｍＲＮＡ 的相对表达量分别为２． １４ ± ０． 、 ２５ ６． １５ ± ０． ２１，高于野生型Ｈｅｌａ 细胞及转入
空载的对照细胞（Ｐ 均＜０． ０１）。结论 成功构建了人Ｃａｌｎｅｘｉｎ 基因慢病毒载体，同时建立、筛选出了能够稳定表
达Ｃａｌｎｅｘｉｎ 蛋白的Ｈｅｌａ 细胞株，为进一步探讨Ｃａｌｎｅｘｉｎ 在宫颈癌发生发展中的作用提供了细胞模型。
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃａｌｎｅｘｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌｎｅｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ
， ， ， ＬＩ Ｈｏｎｇｓｈｕａｉ ＷＡＮＧ Ｘｉｎｔｉｎｇ ＷＡＮＧ Ｙｕａｎ ＹＡＮＧ Ｊｉｅ （ ， ， ） Ｔｉａｎｊｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７０ Ｃｈｉｎａ
： Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｃａｌｎｅｘｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ， ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｌｎｅｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃａｌｎｅｘｉｎ
ｇｅｎｅ ｏｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＴＲＩｚｏｌ． ＲＴＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ
， ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ Ｃａｌｎｅｘｉｎ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｃａｌｎｅｘｉｎ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ； ＥｃｏＲ１ ａｎｄ ＢａｍＨ１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ ｇｅｎｅ ＦＬＡＧＣａｌｎｅｘｉｎ