系统适用性试验
第7节 系统适应性试验
3、重复性
• 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除 另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差 应不大于2.0%。 • 也可按品种校正因子项下，配制相当于80%、 100%、120%的对照品溶液，加入规定量的内 标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少 进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏 差不应大于2.0%。
丁黎
中国药科大学色谱分析课程
第七节
系统适用性实验
• 色谱系统的适用性试验通常包括理论塔板数、 分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其 中分离度和重复性是系统适用性试验中更具 实用意义的参数。
• 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试 验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验， 应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离 条件作适当的调整。
丁黎 中国药科大学色谱分析课程
4、拖尾因子（T）
• 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的 拖尾因子是否符合各品种项下的规定。
丁黎
中国药科大学色谱分析课程
拖尾因子计算公式如下：
T W0.05h 2 A ( A B) 2 A
丁黎
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正常峰（对称） —— T = 0.95 ~ 1.05
色谱峰
非正常峰
前沿峰 —— T < 0.95 拖尾峰 —— T > 1.05
除另有规定外，峰高法定量时 T 应在0.95～1.05 之间。峰面积法测定时，T 值偏离过大，也会影 响小峰的检测和定量的准确度。
丁黎 中国药科大学色谱分析课程
主要内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 色谱分离与保留作用 有关色谱保留的基本术语及参数 塔板理论 速率理论 色谱峰展宽的柱外因素
丁黎 中国药科大学色谱分析课程
高效液相色谱系统适用性试验设计的变化趋势
高效液相色谱系统适用性试验设计的变化趋势周晓源,李雪茹高效液相色谱法（HPLC 法）是药物分析中常用的一种定性、定量色谱分析方法。
具有较强的专属性，相对较高的检测灵敏度和良好的量化功能。
2005版《中国药典》使用HPLC 法的品种中，色谱系统适用性试验设计有了较大的变化：指标更加细致、周到，检测更重实效，色谱系统适用性的试验用溶液的制备方法也呈现多样化，体现出一些变化趋势。
１．色谱系统适用性试验的设计与实验目的更加匹配系统适用性试验的严格细腻程度取决于实验目的。
首先应考虑色谱系统被用于何种实验，根据实验目的来设计系统适用性试验。
如果一个HPLC 方法仅用于定性鉴别，就其色谱系统的适用性试验而言可以相对简单宽松，只要可以确保被测成分峰与其他色谱峰有一定的分离度，具有适宜的出峰时间即可达到实验目的。
如果用于定量分析（如含量测定），则除要保证被测成分峰具有适宜的出峰时间外，还需检验系统是否能够保证被测成分峰与其他色谱峰完全分离，分离度一般应在1.5以上，同时还应测试被测成分峰峰面积的重复性是否良好，对照品溶液连续进样5针的峰面积相对标准偏差应不大于２％，被测成分峰的峰型也应基本对称，以保证分离效果和测量精度。
对于小峰（如占总面积10％以下的色谱峰）峰面积的定量，或用峰高法定量时，就应对拖尾因子或对称因子加以严格的规定，一般来说，拖尾因子应在0.95～1.05之间，因为峰的对称性对测量结果影响较大。
如果检查某种药品的有关物质，且还需要分别检查单个杂质和杂质总量，那么系统适用性试验还应有一个重点，就是要有常见杂质难分离物质对分离度的测定指标。
此外系统的检测灵敏度试验也就相对比较重要。
如盐酸二甲双胍的有关物质检查项下要求：盐酸二甲双胍与双氰胺的分离度应大于1.5，检测灵敏度要求调节双氰胺峰高为满量程的10％。
如果色谱系统是一个梯度洗脱系统，有时一个难分离物质对分离度的测试也不能完全达到实验目的。
如果在梯度变化的前后均有需要检测的杂质，分离度的测定指标一般应根据需要在梯度变化之前和之后都可加以制订。
检验的确认与验证
如何进行方法确认
方法确认 = 简要的方法验证 以含量为例，一般应确认：准确度、精密度 （系统重复性、分析重现性）、专属性。操作 及限度要求同方法验证。 一是确认产品是否适用这个检验方法，尤其是 制剂处方中的辅料是否有干扰。 二是确认实验室的条件能否用这个方法获得准 确的结果，包括仪器设备、环境、人员等。
2、分析方法验证
这部分内容在ICH Q2部分有明确的阐述，但只是在概念上比较 清晰，在实践应用中却不是特别明确，在这里只是对其需要特别 注意的事项作一个补充。 有关物质检测的方法验证具有一定的特殊性，也是最容易被质疑 的方法，这里暂不提到，更多的是其他方面的常见问题。 验证的方法与检验方法不一致是最常见的问题！即使CDE和一 些药检机构可能也没有注意到这一点，而且由于国内注册中大家 都知道的原因造成没有大量数据的积累，进而不会在注册中发现 这个问题所造成的巨大影响，举个例子说明。
如何计算
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
计算时应该采用哪个呢，A、B还是平均值？ 答案其实是都可以，只要检查通过！因为二者 都是正确的，而且你也没办法证明哪个更准确， 也就不能说明平均值会更好。
为什么要平行测定
含量测定时都采用双对照品，请问：计算时应 该采用A还是B，或者是A和B的平均值，抑或其 他，为什么？ 采用两份的平均值会不会增加准确性？ 为什么要做两份，做三份、五份行不行？
平行测定的目的
做两份的目的是用以证明你的称量和配制过程是没有问题的！ 任何操作本身就有误差，就如我们前面所说的那样，你所用的仪 器设备都要确认过的，而且像天平每天都要做校验，但仍然不能 避免误差，更何况还有可能出现人为误差，而这些误差并不见得 你在操作过程中就可以发现（发现了你就该重新配了）。在你的 仪器例如HPLC已经确认完成的基础上，进样平行样品，如果有 操作导致的误差可能被发现（当然三份时发现的机会就更大）。 简单举个例子，你在称量时出现洒的机率是1%，那么称两份时 出现洒的机率就是万分之一。
工业制备液相色谱系统的验证流程
工业制备液相色谱系统的验证流程如下：
1.系统适用性试验：一般包括理论板数、分离度、重复性
和拖尾因子等项目的考察。
2.专属性试验：专属性系指在其他成分（如杂质、降解产
物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测
定出被测物的特性。
专属性试验就是一项证明所建立的
方法确实可用于测定被测物的试验。
3.线性与范围：线性通常指的是在一定范围内，测试结果
（响应值）与被测物浓度（量）直接呈正比关系的程度。
在实际应用中，线性范围是指在测试误差能满足预定要
求的前提下，用特定方法能够测试的被测物的最低浓度
（量）至最高浓度（量）的范围。
4.检测限与定量限：检测限指试样中被测物能被检测出的
最低量。
定量限指试样中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度。
5.耐用性：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结
果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。
分析方法确认与验证管理规程
一、目的：规范药品检验方法确认与验证的管理，证明采用的方法适合相应的检测要求及在实验室条件下的适用性，保证检验结果准确、可靠。
二、适用范围：适用于中药和化学药品（包括物料和产品）的理化分析方法和仪器分析方法的确认与验证。
不适用于中药和化学药品（包括物料和产品）微生物分析方法的确认与验证。
三、相关职责：QC班组长：QC班组长根据检验方法的来源确定开展方法确认或验证。
由其本人或者其他有经验的检验人员起草方案；负责确认或验证方案的培训；安排有经验的人员参与方法确认或验证过程实施；对确认或验证过程中出现的偏差要严格按照相关管理规程的程序执行，如需要提出变更申请；对确认或验证工作中出现的问题及时纠正并记录；总结确认或验证报告。
QC主管：负责审核检验方法确认或验证方案，并对方案的执行过程进行追踪；负责组织偏差的调查，变更的审核；负责总结报告的审核。
化验室QA：监督各项目按照已制定的方案进行；参与确认或验证过程中的偏差调查；对提出的变更进行评估，确认变更的是否成立，跟踪变更实施。
QA主管：负责审核检验方法确认或验证方案，确保其法规符合性；参与偏差的调查，变更的审核；负责总结报告的审核。
验证专员：审核检验方法确认或验证方案；审核总结报告；负责验证证书的发放；负责方法确认或验证方案、记录和报告的整理、存档。
质量管理负责人：批准检验方法确认或验证方案；批准方案实施过程中出现的偏差和变更；批准总结报告。
四、制定依据：《药品GMP指南》（质量控制实验室与物料系统）、《药品生产质量管理规范》（2010年修订）、《中国药典》（2020年版）、《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、ICH分析方法验证：正文和方法学Q2（R1 ）、中国药品检验标准操作规范（2010年版）（原子吸收分光光度法）。
五、内容：1、术语1.1方法验证方法验证系指根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
ChP、USP、EP、JP、BP对系统适用性的要求
ChP、USP.EP、JP、BP对系统适用性的要求系统适用性是液相和气相色谱方法的重要组成部分,用来确认色谱系统的分离度和重复性能够满足特定的分析要求。
测试是基于将仪器、电路、实验者和样品作为一个整体进行的。
美国药典规定任何色谱试验一定要进行系统适用性测试，否则，这台仪器做出的数据一律无效;ICH 提出一定要将系统作为整体来测试;FDA提到应确定一SOP进行测试确保系统可用；英国药典规定建立系统适用性是为了任何使用方法时都是有效的；欧洲药典提出系统适用性测试反映了色谱系统性能，是建立分析方法不可或缺的一部分；日本药典与美国药典叙述基本一致；GMP指出检查分析方法验证过程时，应涉及是否开发了系统适用性试验，并且对每一项系统适用性试验的参数都进行定义；中国药典并没有单独对系统适用性目的进行叙述，国内色谱工作者往往对系统适用性不够重视，看似简单的系统适用性其实有很多需要关注的地方，其重要性不比方法学中其他验证项差。
一、美国药典系统适用性的要求美国药典并没有明确对分离度、理论塔板数、拖尾因子、重复性及灵敏度的统一要求，在药典正文中各个品种项下分别规定。
当采用标准品或标准品溶液需要重复进样以判断系统的精密度，除非个论中有规定，系统适用性5针的数据的相对标准偏差不得超过2.0%,当超过2.0%时，需要计算连续6针进样的数据。
在含量测定中，系统适用性的相对标准偏差与进样次数和含量限度上限有关，表1是USP对含量系统适用性测试相对标准偏差的规定。
表1USP对含量系统适用性RSD的要求关于对称因子规定参考笔者撰写《拖尾因子、对称因子和不对称因子区别理论》，在此不做赘述。
当系统适用性不符合要求时可以适当调整方法参数，不过每个变量的最大值都应该进行验证其系统适用性，对改变后的方法进行重新评价。
表2是USP对参数调整的规定。
表2USP对系统参数再调整的规定二、欧洲药典和英国药典系统适用性的要求欧洲药典和英国药典对系统适用性要求也做了非常详细的规定，并且对保留时间、保留体积、死体积、死时间等概念做了详细描述。
理化分析方法的检测限、定量限和耐用性验证及案例
理化分析方法的检测限、定量限和耐用性验证及案例检测限和定量限检测限定义为样品中被分析物能够检出但无需准确定量的最低量。
检测限常常与方法的灵敏度相混淆，灵敏度是以响应值对被分析物的浓度或质量作图所得校正曲线的斜率。
定量限（LOQ）定义为能够以适当的精密度和准确度对样品中的被分析物进行定量测定的最低量。
定量限和检测限测定方式包括：a) 视觉判断通过测定待测成分浓度已知的样品，并确定该成分能被可靠检出的最低水平来计算检测限。
如重金属测定法。
b) 信噪比法通过比较测得的已知低浓度的样品信号和空白样品的信号，建立能够监测的被测物的最低浓度所得到的方法。
如色谱法。
c) 基于空白的响应值标准偏差通过分析适当数量的空白样品并计算所得响应值的标准偏差来测量分析背景响应值的大小。
如光谱法。
检测限数据须用含量相近的样品进行验证。
应附测定图谱，说明试验过程和检测限结果；定量限数据还应包括准确度和精密度验证数据。
图1 通过信噪比评价检测限和定量检测限和定量限测定方法（信噪比法）示例：在最灵敏的仪器状态下,测定至少四个空白样品,洗脱时间需覆盖整个样品中所有组分的流出，计算平均噪声水平；然后按信噪比大于2而小于6 配制所有组分的样品溶液，每个样品进样三次,计算该组分的最小检测限；然后按信噪比等于10.0±0.5 配制样品溶液，连续进样三次计算组分的最小定量限。
耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。
确定方法的耐用性时，使一系列的方法参数在一定的范围内变动，测定这些变动对结果的量化影响。
常见的耐用性考察因素示例如下表。
如果参数的影响在预先设定的允许范围内，则证实方法在该参数范围内耐用。
表1 常见耐用性考察因素耐用性试验可以确定分析方法的关键参数及其允许的容量范围，并可以帮助评估一种或某种参数变化后方法是否需要重新验证。
在方法开发阶段应考虑通过风险评估的方式确定耐用性试验因素设计，这也是“质量源于设计”（QbD）在方法开发中的体现。
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原则
• 使用GC和HPLC进行含量分析，分析者首先应完成方法规定的系统适用 性试验；只有确信系统适用性试验满足方法规定的要求后，才能进行 样品的分析检验。
• No sample analysis is acceptable unless the requirements of system suitability have been met.
tR--保留时间 W1/2——半峰宽
8
分离度R
• 分离度是评价相邻峰分离程度，或内标峰与主峰 的分离程度，便于定量分析时确定测定结果的准 确性。
9
分离度（R>1.5）
• tR2相邻两峰中后一峰 的保留时间
• tR1相邻两峰中前一峰 的保留时间
• W1及W2为此相邻两峰 的峰宽
RS＝用性试验满足要求，否则样品分析无效。 • Sample analyses obtained while the system fails
requirements are unacceptable. 系统适用性试验失败，样品分析结果是不能接受的。
17
USP要求
• 除了在样品分析前进行系统适用性试验外，在进 样中间、样品分析完成后，要进行系统精密度评 价。
2
系统适用性试验
2005-09
3
引用法规
• 各国药典要求：USP/EP/BP/JP/CP • FDA、欧美客户审计检查色谱记录必查内容
实验室检查易出问题的地方 最易被国内企业忽视的问题
4
系统适用性试验概念
• GC和HPLC完整分析的一部分； • 确认色谱系统的分离度和重现性； • 是用规定的对照溶液或测试溶液对仪器进行试验
• 在各品种项下对系统适用性试验未有明确要求的， 测定结果应满足该方法或药典版本通则的要求。 如R>1.5，RSD不大于2.0%。
15
USP的要求
• 调节操作条件以满足系统适用性要求是允许的；
• 除非在专题中特别说明，系统适用性参数以待测组分测定；为了评价 系统的精密度，需要在进样前、进样中(以一定的时间间隔)、进样后 进适当的控制样品评价；
cGMP标准下实验室系统 达标培训
1
内容目录
• 系统适用性试验 • 标准品及工作标准品的管理 • 超限结果的调查(OOS) • 药品稳定性研究(包括长期、 加速、 破坏性) • 分析仪器的内部校验 • 分析仪器的验证 • 分析方法的验证 • FDA/EMEA现场检查的准备及应对 • 中国企业应对FDA/EMEA检查的经验交流
dl
W0.05h
13
相对标准偏差RSD
• 标准连续进样至少５次或６次，计算峰面积的重 复程度。
• USP和EP要求：当规定的RSD≤2.0%时，标准溶液
需要重复进样５次；当规定的RSD≥2.0%时，标准
溶液需要重复进样６次，如残留溶剂测定， RSD≤15%。
14
系统适用性试验的要求
• 在各品种项下对系统适用性试验有明确要求的， 测定结果应满足该方法或药典各品种项下的规定。
• 但，变动要考虑接受程度。
20
483表关于系统适用性试验
• 首次5张图谱不连续 • 图谱时间不连续 • 系统适用性试验 没进行或进行不充分 • 对策： • SOP中有详细规定 • 有记录 • 图谱有计算
21
SUCCESS
THANK YOU
2019/5/13
• 针对色谱特点：漂移、影响因素多。
6
评价参数
• 理论塔板数N 以被分析物主峰或规定的色谱峰计算柱效，以确 定色谱峰的尖锐程度，尤其在痕量组分测定中尤 为重要。
7
• 理论塔板数（N）
( dP＝10μ N＝5万 ) ( dP＝5μ N＝10
2
N＝5.54
tR W1/
2
万)
dP—柱填料 的颗粒直径
• HPLC的固定相种类、 流动相组分、 检测器类型及波长； GC的检测器类型、固定液品种及特殊的色谱柱材料，均不 得任意改变。(CP)
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色谱条件的调节要求(２)
• USP:流动相比例可以调整，色谱柱长度、 内径、 粒度、 进样量不得改变。
• 以上可改变的色谱条件，其变动幅度，除非有特殊要求， 可参照EP4规定的变动幅度适当变化。
)
10
SUCCESS
THANK YOU
2019/5/13
拖尾因子Ｔ
• 拖尾因子Ｔ是评价色谱的对称性，便于保证峰积 分时的测量精度，尤其采用峰高法计算含量时。
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拖尾因子
• T=W0.05h/2dl • W0.05峰高处的峰宽 • dl为峰极大至前言之间
的距离
• 峰高定量时,T应在 0.95~1.05之间
• 评价的样品：标准溶液或已知含量的样品；
• 如仪器或关键试剂有明显改变，在进样前应先进行系统适用性试验； • No sample analysis is acceptable unless the requirements of
system suitability have been met. sample analyses obtained while the system fails requirements are unacceptable.
• 参考处理办法：SOP定义，如首5-中-2-末1。 • 间隔：3-4批(6-8次进样)或3个小时(参考)。 • 计算RSD以评价：首5-中7-…-+2-末1。 • RSD≤2.0%(含量测定)。
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色谱条件的调节要求(1)
• 除非药典或方法中有明确要求，HPLC色谱条件如色谱柱柱 长、内径、流动相、流速、柱温、进样量、检测器的灵敏 度；GC的色谱柱长度、内径、载体牌号内径、粒度内径、 固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵 敏度等均可适当调整，以满足系统适用性试验的要求。 (CP)
和调整，应达到方法规定的要求；或规定状态下 的色谱柱的最小理论塔板数N 、分离度R 、拖尾 因子Ｔ、及相对标准偏差RSD符合要求。 • 其评价的是检测中仪器、电信号、分析操作及样 品等方面的综合特性。
5
目的及使用范围
• 色谱：主要是GC和HPLC • 其评价的是检测中仪器、电信号、分析操作及样
品等方面的综合特性。