SDSPAGE电泳试剂配制
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
sds page 配置方法
实验步骤：
1、准备 SDS-PAGE 凝胶 [1]. 按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。 [2]. 装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。 [3]. 确定凝胶浓度体积，按表12-2配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯配制。 [4]. 小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到足够高度。 注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）。 [5]. 轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝 胶聚合的抑制作用。 [6]. 凝胶充分聚合。时间约30~60min, 聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。 [7]. 倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液 体。 [8]. 按表12-3配制浓缩胶，并注入分离胶上端。插入梳子。插入梳子子应小心避免梳子顶 端留有气泡。
[4]. 10 % SDS（十二烷基硫酸钠）(电泳级)：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至 100ml，室
温保存。 [5]. 10% 过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵溶解于 1ml 双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应每周
新鲜配制。 [6]. TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二胺）： 原液使用。应使用电泳级 TEMED。 [7]. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M 甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。
聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr），在交联剂甲叉双 丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物（图 12-1）。
图 12-1 丙烯酰胺的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基， 过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）和 N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine， TEMED）就是这样的催化诱发系统。聚丙烯酰胺的聚合反应是通过加入过硫酸铵启动的，添加 TEMED 加速聚合反应。过硫酸铵提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基。诱发剂 TEMED 能加速过硫酸铵形成自由基，使丙烯酰胺单体转变为自由基态。被激活的单体和未被激活的单 体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互连 成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。溶液的 pH 对聚合作用是重要的，因为过低 pH 没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝 胶时，在加过硫酸胺之前，混合物必须抽去空气。 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于 SDS 和巯基乙醇作用，使得蛋白质分子中二硫键还 原，氨键、疏水键打开，SDS 按 l.4g SDS/1g 蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成 SDS-多肽复合物。因十二烷基磺酸根带负电，使各种 SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDS-PAGE超详细实验步骤
SDS-PAGE超详细实验步骤1定义SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中SDS为十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate），PAGE为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electropheresis）；该电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
1.1试验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的静电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
1.2试验相关设备与试剂配制1.2.1相关设备(1)电泳仪(2)凝胶成像仪(3)干浴器(4)微型离心机(5)电泳槽1.2.2试剂配制(1)染色液：用量筒分别量取250ml甲醇或乙醇、80ml乙酸；用电子天平称取考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml蓝盖瓶中（加入顺序为考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸），用纯化水补足至1000ml，充分混合均匀后进行用滤纸过滤，收集滤液备用。
（当过滤速度变慢时及时更换滤纸，快速过完，不可隔夜以免影响染色效果）(2)脱色液：用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml纯化水加入烧杯中，待溶液混合均匀后加入蓝盖瓶中。
(3)1X电泳缓冲液：分别用量筒量取10X电泳缓冲液100ml、900ml纯化水加入烧杯中，混合均匀既得。
（注：以上甲醇、乙醇、乙酸均用分析级试剂，纯度>95.0%）1.3电泳试验步骤1.3.1电泳胶配制（配方如表1）：表1分离胶浓度(10ml) 6%(ml) 8%(ml) 10%(ml) 12%(ml) 15%(ml) 去离子水 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30%Acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4.0 5.04X Resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.110%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 表2堆积胶(ml) (ml)去离子水 6.930%Acrylamide mix 1.78X Stacking-gel buffer 1.2510%SDS 0.110%APS 0.1TEMED 0.01按照表1配方将所需浓度的分离胶配置好（加入顺序由上到下），加入到电泳胶配胶板中（约3/4配胶版高度），加入5mm高的纯化水，等待30-60min使分离胶凝固（可微微倾斜看胶面是否凝固聚合）。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
Tricine-SDS-PAGE
Tricine-SDS-PAGE 实用方案Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。
一、 试剂配配制：1．Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C）Acylamide 48.0gBis 1.5gWater make up to 100ml2.High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C)Acrylamide 46.5gBis 3.0gWater make up to100ml3.Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS)SDS 0.3gTris 36.4gWater make up to 100mlPH to 8.45 with HCL注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下:Tris 36.4gSDS 0.3gWater make up to 150ml4.Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液 (0.2M Tris/cl, PH8.9)Tris 12.11gWater make up to 500mlPH to 8.9 with HCL5.Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液 (0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25)Tris 6.06gTricine 8.96gSDS 0.5gWater make up to 500ml注:不用调PH值6.4×Tricine SDS Sample buffer 4×上样缓冲液(Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01%8×Tris.cl/SDS PH 6.8 2mlGlycerol 4.8mlSDS 1.6gCommasie Blue G 250 4mgWater make up to 10ml注:8×Tris.cl/SDS PH 6.8配方Tris 6.05gSDS 0.4gWater make up to 100mlPH to 6.8 with HCL二、 胶的配制1.16.5% T 6% C separating gel 30ml49.5% T 6% C 10mlGel buffer 15mlGlycerol 3.2mlWater 1.8ml2. 10% T 3% C spacer gel 30ml49.5% T 3% C 6.1mlGel buffer 15mlWater 8.9ml3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml49.5% T 3% C 1mlGel buffer 4.65mlWater 6.85ml注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml;Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED.胶配制的通用配方:16.5% T , 6% C separating gel (ml)30 6 8 1049.5% T 6% C 10 2 2.6667 3.3333Gel buffer 10 2 2.6667 3.333350% Glycerol 6.4 1.28 1.7067 2.1333water)3.6 0.72 0.96 1.2DTW(distilled0.02670.03330.0210%AP 0.10.00330.0027TEMED 0.010.00210% T 3% C Spacer gel (ml)51.66671.333313%C 1.05 0.21 0.28 0.35T49.5%buffer 1.65 0.33 0.44 0.55Gel0.76670.6133DTW 2.30.46AP 0.0165 0.0033 0.00440.005510%TEMED 0.00165 0.0003 0.0004 0.00064% T 3% C Stacking gel (ml)2.08331.66676.251.2549.5% T 3% C 0.5 0.1 0.1333 0.1667Gel buffer 1.55 0.31 0.4133 0.5167DTW 4.2 0.84 1.12 1.40.01330.01670.0110%AP 0.050.00170.0013TEMED 0.0050.001三、 电泳参数及染色脱色1.用Bio-Rad mini 电泳装置进行电泳. 30V 电泳1hr, 100V至电泳结束2.固定, 染色及脱色: 小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后, 有时需要固定20min (固定液乙醇), 再进行染色20-30min (染色液: 50%甲醇, 10% 乙醇在脱色液 (45% 甲醇, 10% 冰醋酸)脱色20-30min; 脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.四、 电泳示例照片。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
SDS-PAGE实验步骤
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。
6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。
放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。
电泳1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦2拭，晾干；2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；O 3.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=8.82.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul10%AP 56 ul TEMED 6 ul4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；O 2.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ul30% Acr-Bis 600 ul 10% SDS 36 ul10%AP 24 ul TEMED 4 ul6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
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SDS-PAGE电泳试剂
1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，
37OC溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4OC；
2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)： Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；
3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)： Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；
4) 4?分离胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；
5) 4?浓缩胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；
6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解,定
容至100mL；
7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）： 1g AP加ddH2O至10mL；
8) 2?SDS电泳上样缓冲液： 1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，
甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH2O 3.5mL；
9) 考马斯亮兰染色液： 考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；
10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；
11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL， 4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps
0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；
12) 浓缩胶（5％）： ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL， 10%Aps
50μL，TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳
1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
1） 正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至
500mL。
2） 负极缓冲液(10 ×)： 将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸
水中,加水至终体积为500mL。
3） 凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M HCl
滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。
2 丙烯酰胺储存液配制
1） 3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)
将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。
2） 5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)
用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。
3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作
1） 小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离
子水稀释至3 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
2） 夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至
3 mL , 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
3） 浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水
稀释至2 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩
胶。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析
1）准备：
电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安
装好电泳装置。
2）12.5%分离胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 4mL
30%储备胶 5mL
4?分离胶缓冲液 3mL
10% Aps(现配) 0.1mL
100%TEMED 0.01mL
轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。
3）5％浓缩胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 2.65mL
30%储备胶 0.85mL
4?浓缩胶缓冲液 1.25mL
10% Aps 50 μL
100%TEMED 5 μL
待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插
入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。
4）上样与电泳
将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极
连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流
电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约
3小时。
5）染色及脱色
电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液
浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后用数码
像机拍照保存。