sdspage电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制在生物化学和分子生物学的研究领域中，SDSPAGE 电泳是一种常用的技术手段，用于分离和分析蛋白质。
而要成功进行 SDSPAGE 电泳实验，准确配制各种试剂是至关重要的一步。
接下来，让我们详细了解一下 SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。
首先，我们来谈谈分离胶缓冲液的配制。
分离胶缓冲液通常使用TrisHCl 缓冲液，其 pH 值一般在 88 左右。
配制时，我们需要称取一定量的 Tris 碱，然后加入适量的浓盐酸进行调节 pH 值。
这个过程需要用到 pH 计来精确测量，以确保 pH 值的准确性。
一般来说，每升分离胶缓冲液中，Tris 的用量约为 1815g，而浓盐酸的用量则需要根据实际测量的 pH 值进行调整。
接下来是浓缩胶缓冲液的配制。
浓缩胶缓冲液的 pH 值通常为 68，同样使用 TrisHCl 缓冲液。
配制方法与分离胶缓冲液类似，但 Tris 的用量和浓盐酸的用量有所不同。
每升浓缩胶缓冲液中，Tris 的用量约为 606g，浓盐酸的用量也需要根据实际 pH 值测量结果进行微调。
然后是 30%丙烯酰胺溶液的配制。
这是 SDSPAGE 电泳中的关键试剂之一。
丙烯酰胺是一种有毒物质，在配制过程中需要特别小心。
我们将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照 29:1 的比例混合。
称取 29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺，加入适量的去离子水，搅拌溶解后，定容至 100ml。
需要注意的是，丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套在通风橱中进行。
SDS 溶液的配制也不能马虎。
SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂。
称取 10g SDS，加入适量的去离子水，加热搅拌溶解后，定容至 100ml。
10%过硫酸铵溶液是引发丙烯酰胺聚合的重要试剂。
称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。
因为过硫酸铵溶液不稳定，容易分解，所以不宜长时间保存。
电泳缓冲液也是必不可少的。
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量一、药剂准备a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml3、10%SDS 5ml4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。
可可5、TEMED 0.5 ml6、1M Tris-HCL,PH6.8 15mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml，1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（1L）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。
（不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：甲醇或者乙醇乙酸250ml 80ml去离子水补至 1000ml,混匀，备用。
二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE 分析操作过程：1、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。
确保质量分数为3～5g/L。
试管依次标号1、2、3、4、5。
用保鲜膜和皮筋封口保存备用。
最好当天现配。
2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。
按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。
依照15%胶，5ml（打勾）一栏。
如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。
a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。
b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly-
Gly- Gly-
蛋白质离子
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl- Cl-
Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度
pH8.8
10%
Pr-运动加速 浓缩效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97)
pH6.8
5% Gly- Gly- - Gly Gly Cl Cl- -Gly Cl- -
蛋白质离子
Gly-GlyGly-Gly-
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动
- - - Cl - Cl -Cl Gly Cl Cl- -Cl Gly Gly Gly Gly Gly
pH8.8
10%
分子筛效应
实验原理
• 分子筛效应
主要离子
氯离子 甘氨酸蛋白质离子 甘氨酸解离增加
加入分离胶溶 液 pH 8.8
封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
制备浓缩胶(浓缩胶)
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
分离胶 pH 8.8
样品处理
Sample buffer
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
实验流程
配胶
配分离胶(下胶)
配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h） 染色（20min） 脱色（30min~2h） 分析
实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)
SDS-PAGE所有详细试剂配方
SDSPAGE之迟辟智美创作30%聚丙烯酰胺溶液30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充沛搅拌溶解，补加水至终体积为100ml.0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管.严格核实PH不得超越7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的.使用期不得超越两个月，隔几个月须重新配制.如有沉淀，可以过滤.【保管条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性.称量丙烯酰胺和N,N’亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具.可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎把持，因为它还可能含有少量未聚合资料.1MTrisHCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTrisHCL【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充沛搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4年夜约0.7mL，7.6年夜约0.6mL，8.0年夜约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保管.应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变动不同很年夜，温度每升高1℃，溶液的pH值年夜约降低0.03个单元.【保管条件】室温保管.【注意事项】对人体有安慰性，请注意适当防护.1.5MTrisHCL（pH8.8）(分离胶buffer)【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充沛搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保管.（1.5mmol/LTrisHCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积.过滤后40C保管.）【保管条件】室温保管【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变动不同很年夜，温度每升高1℃，溶液的pH值年夜约降低0.03个单元.10%十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS【配制方法】称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保管【保管条件】室温保管【注意事项】保管条件： 4℃保管. 注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套把持.保管条件： 4℃保管. 注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护.10%过硫酸铵溶液10%(w/v)AP【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵【配制方法】称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水奏乐溶解，4℃保管【保管条件】4℃保管【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保管时，可使用2周左右，超越期限会失去催化作用5×Tris甘氨酸电泳缓冲液 5×TrisGlycine buffer （SDSPAGE 电泳缓冲液）【组分浓度】【配制方法】称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充沛搅拌溶解，定容至1000ml，室温保管.得0.125mol/L Tris1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液.临用前稀释5倍.【保管条件】室温保管，两年有效.【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超越两周.电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用12次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液.5×SDSPAGE加样缓冲液 5×SDSPAGE Loading Buffer【组分浓度】0.25MTrisHCL(pH6.8)；10%(W/V)SDS；0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝)；50%(V/V) 甘油；5%(W/V)β巯基乙醇(2ME)【配制方法】量取 1.25mL 1MTrisHCL（pH6.8），0.5g SDS，25mg BPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保管.使用前将25μL的2ME加入到每小份中.加入2ME的Loading Buffer可在室温下保管一个月左右.【保管条件】20℃保管，至少一年有效.【注意事项】SDSPAGE卵白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微安慰性气味，必需完全溶解后再使用.摘自Takara 商品目录实验室惯例试剂配制方法TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇。
SDS-PAGE Western 蛋白质电泳常用溶液配制
0.5 0.03 19.8 16.7 12.5 0.5 0.5 0.02 16.5 20 12.5 0.5 0.5 0.02 11.5 25 12.5 0.5 0.5 0.02
0.05 0.003 1.9 1.7 1.3 0.05 0.05 0.002 1.6 2 1.3 0.05 0.05 0.002 1.1 2.5 1.3 0.05 0.05 0.002
0.1 0.006 4 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 3.3 4 2.5 0.1 0.1 0.004 2.3 5 2.5 0.1 0.1 0.004
e）配方表
6ml 4.1 1 0.75 0.06 0.06 0.006 8ml 5.5 1.3 1 0.08 0.08 0.008 10ml 6.8 1.7 1.25 0.1 0.1 0.01
分取样量
表
30ml 15.9 6 7.5 0.3 0.30ml 21.2 8 10 0.4 0.4 0.032 18.5 10.7 10 0.4 50ml 26.5 10 12.5 0.5 0.5 0.04 23.2 13.3 12.5 0.5
抗生素溶液贮存液及工作浓度
抗生素 氨苄青霉素 羧苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 链霉素 四环素 贮存液 浓度 mg/ml 贮存条件 50（溶于水） -20 50（溶于水） -20 34（溶于乙醇） -20 10（溶于水） -20 10（溶于水） -20 5（溶于乙醇） -20 工作浓度（ug/ml） 严紧型质粒 松弛型质粒 20 60 20 60 25 170 10 50 10 50 10 50
0.15 0.009 5.9 5 3.8 0.15 0.15 0.006 4.9 6 3.8 0.15 0.15 0.006 3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.006
SDSPAGE凝胶电泳2
凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由 于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后 双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比 色杯中，可观察到20~30 min后光吸收读数开始 下降，至80 min以后趋于稳定，说明聚合完成。
５．电泳
将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中， 上样，选择适当的电压进行电泳。
同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要 摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。 吸去不连 续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的 液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意 不得在齿尖留有气泡。 静置90 min以上以保证 完全聚合。 如果在聚胶过程中发现一道道纹线， 即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂 未充分混合导致局部浓度过高。
（1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水
定容至1000ml
（1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-
0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g， 加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml
２. 聚胶前准备
被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧 化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质 量。如果无法获得无色透明的TEMED，只 能适当增加用量以保证聚胶速度。
4. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水
后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过 硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵 应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。 另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量， 否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要 指天然无变性剂凝胶)。
称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐 酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。
SDSPAGE电泳试剂配制
S D S-P A G E电泳试剂1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100mL,棕色瓶存于4O C；2)1.5MTris-HCl(pH8.8)：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3)1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100mL；4)4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5MTris-HCl(pH8.8)，定容至100mL；5)4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1MTris-HCl(pH6.8)，定容至100mL；6)10?电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.029g，甘氨酸14.415g，SDS1g加ddH2O溶解,定容至100mL；7)10%过硫酸铵（Aps,现配）：1gAP加ddH2O至10mL；8)2?SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS0.6g，甘油2.0mL，0.1%溴酚兰1.0mL，ddH2O3.5mL；9)考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225mL，冰醋酸50mL，ddH2O225mL；10)脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11)分离胶(12.5%):ddH2O4mL，30%储备胶5mL，4?分离胶缓冲液3mL,10%Aps0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；12)浓缩胶（5％）：ddH2O2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps50μL，TEMED5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）-SDS-PAGE蛋白质电泳1Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10×)：14gTris溶于400mL重蒸水,用1.0MHCl调至pH8.9,定容至500mL。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
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SDS-PAGE电泳试剂
1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；
2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,
定容至100mL；
3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；
4) 4⨯分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；
5) 4⨯浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；
6) 10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL；
7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；
8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL；
9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；
10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；
11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；
12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳
1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。
2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。
3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M
HCl
滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。
2 丙烯酰胺储存液配制
1）3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)
将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。
2）5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)
用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。
3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作
1）小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL
的TEMED。
2）夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
3）浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至2 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
用垂直小电泳槽制胶电泳。
先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析
1）准备：
电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。
2）12.5%分离胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 4mL
30%储备胶5mL
4⨯分离胶缓冲液3mL
10% Aps(现配) 0.1mL
100%TEMED 0.01mL
轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。
3）5％浓缩胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 2.65mL
30%储备胶0.85mL
4⨯浓缩胶缓冲液 1.25mL
10% Aps 50 μL
100%TEMED 5 μL
待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。
4）上样与电泳
将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分
离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约3小时。
5）染色及脱色
电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后用数码像机拍照保存。