SDS-PAGE试剂配方
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制在生物化学和分子生物学的研究领域中，SDSPAGE 电泳是一种常用的技术手段，用于分离和分析蛋白质。
而要成功进行 SDSPAGE 电泳实验，准确配制各种试剂是至关重要的一步。
接下来，让我们详细了解一下 SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。
首先，我们来谈谈分离胶缓冲液的配制。
分离胶缓冲液通常使用TrisHCl 缓冲液，其 pH 值一般在 88 左右。
配制时，我们需要称取一定量的 Tris 碱，然后加入适量的浓盐酸进行调节 pH 值。
这个过程需要用到 pH 计来精确测量，以确保 pH 值的准确性。
一般来说，每升分离胶缓冲液中，Tris 的用量约为 1815g，而浓盐酸的用量则需要根据实际测量的 pH 值进行调整。
接下来是浓缩胶缓冲液的配制。
浓缩胶缓冲液的 pH 值通常为 68，同样使用 TrisHCl 缓冲液。
配制方法与分离胶缓冲液类似，但 Tris 的用量和浓盐酸的用量有所不同。
每升浓缩胶缓冲液中，Tris 的用量约为 606g，浓盐酸的用量也需要根据实际 pH 值测量结果进行微调。
然后是 30%丙烯酰胺溶液的配制。
这是 SDSPAGE 电泳中的关键试剂之一。
丙烯酰胺是一种有毒物质，在配制过程中需要特别小心。
我们将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照 29:1 的比例混合。
称取 29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺，加入适量的去离子水，搅拌溶解后，定容至 100ml。
需要注意的是，丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套在通风橱中进行。
SDS 溶液的配制也不能马虎。
SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂。
称取 10g SDS，加入适量的去离子水，加热搅拌溶解后，定容至 100ml。
10%过硫酸铵溶液是引发丙烯酰胺聚合的重要试剂。
称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。
因为过硫酸铵溶液不稳定，容易分解，所以不宜长时间保存。
电泳缓冲液也是必不可少的。
SDS-PAGE所有详细试剂配方
S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTris-HCL名称用量备注Tris 12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
【保存条件】室温保存。
【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。
1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5MTris-HCL名称用量备注Tris 18.17g去离子水80ml浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
SDS-PAGE试剂配方
SDS-PAGE试剂配方SDS-PAGE电泳所用溶液:30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)丙烯酰胺 (Arc) 29 gN,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4?存放丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH 值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4?贮存。
5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)Tris碱 15.1 g甘氨酸(电泳级) 94 g10 %SDS 50 mL使用时稀释5倍使用2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL10,(W/V)SDS 4 mL甘油 2 mLβ-巯基乙醇 1.0 mL(DTT(二硫苏糖醇) 0.31g)溴酚兰 0.02g双蒸水 0.5 mL室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 (G-250) 1.0 g甲醇 450 mL冰醋酸 100 mLddHO 450 mL 20.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95,乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液(甲醇脱色液效果好，但有毒性)甲醇 100 mL冰醋酸 100 mLddHO 800 mL 2医用酒精:冰醋酸:水=4.5:0.5:5(V:V:V)SDS-PAGE所需溶液:A液——30,丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4?贮存。
B液——1.5mol/L Tris?HCl，pH8.8:18.17g(9.09g)Tirs碱，溶于80mL(40mL)去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL(50mL)。
C液——1.5mol/L Tris?HCl，pH6.8:12.1g(6.05g)Tirs碱，溶于80mL(40mL)去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL(50mL)。
SDSPAGE所有详细试剂配方精修订
SDSPAGE所有详细试■ 剂配方SANY 标准化小组#QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN# 称S181.7gTrisfi«溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解.加浓HCL调节所需耍的pH值=8・&将洛液定容至ILt 高温高压灭菌后.室温保存。
(1. 5mmol/LTris"HCL(pH8. 8) : 18. 15gTris 和48mllmol/LHCL 混合.加水稀释到100ml 终体积。
过滤后4七保存。
)【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，I大I为Tris溶液的pH值随温度的变化差界很大.温度每升商1°C,溶液称取2g高纯度的SDS迓于100、200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水.689加热溶解.滴加浓盐酸调节PH 至7・2・定容至20ml后，室温保存【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害•请注总:防护。
io%过硫酸鞍溶液------ io%(w G AP称取O・lg过硫酸钱宜于l・5ml离心管•加ImL去离子水吹打溶解.JC保存【保存条件】49保存【注意事项】10%过疏酸钱溶液在49保存时•可使用2周左右•超过期限会失去催化作用5XTris-酸电泳缓冲液------------ oXTris-Clycinebuffer (SDS-PAGE 电泳缓冲液)【组分浓度】称取15. IgTris, 91. 0g甘氮酸(glycine) , 5. OgSDS,用800ml蒸馅水或去离子水溶解.充分搅拌溶解•定容至1000ml,室温保存。
得0・125mol/LTris7 25mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释5倍。
【保存条件】室温保存•两年有效。
【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。
电泳缓冲液可以回收.回收后可再使用「2次.但为了取得最佳的电泳效果,应使用新电泳液°0. 25MTris-HCL (pH6. 8)：10%(W/V)SDS：0. 5%(W/V)BPB(^酚蓝):50%(V/V)廿油：5%(W/V) 0-筑基乙醇(2-ME)【配制方法】fit取1.25mLlMTris-HCL (pH6・8) , 0・5gSDS, 25mgBPB・2・5mL甘油,宜于lOmL塑料离心管中■加去离子水溶解后•定容至5mL,小份(0・5mL/份)分装，于室温保存。
SDS-PAGE实验步骤
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。
6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。
放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。
电泳1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦2拭，晾干；2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；O 3.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=8.82.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul10%AP 56 ul TEMED 6 ul4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；O 2.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ul30% Acr-Bis 600 ul 10% SDS 36 ul10%AP 24 ul TEMED 4 ul6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理
SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
sds-page 试剂配制
SDS-PAGE 试剂配制
凝胶脱色染色方法：
溶液1：无水乙醇250mL，冰醋酸50mL，水200mL；
溶液2：无水乙醇50mL，冰醋酸37.5mL，水437.5mL；
溶液3：0.25g考马斯亮蓝R-250 溶于100mL 95%乙醇中，滤纸过滤，待用。
电泳结束，取出胶放在胶盒中，加约50mL溶液1，微波炉加热1min，摇床摇10-20nin；倒掉溶液1，加入溶液2，再加1mL溶液3，混匀，微波炉加热1min，摇床摇，直至条带染色清晰为止。
上样缓冲液（5×）：（5×loading buffer）有
10%（W/V,g/ml）过硫酸铵（APs）的配制：（1ml）
1.称取0.1g过硫酸铵；
2.加入1ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；
3.贮存于4℃。
注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会失去催化效果。
5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：（1L）
1.称取Tris粉末15.1g、Glycine（甘氨酸）94g、SDS5.0g；
2.加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；
3.加去离子水定容至1L，室温保存。
注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项
SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
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0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
12%胶
水
1.6
3.3
4.9
6.6
8.2
9.9
13.2
16.5
30%丙烯酰胺混合液
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
冰醋酸100mL
ddH2O800mL
医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
SDS-PAGE所需溶液:
A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。
16.0
20.0
1.5mol/L Tris(pH8.8)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10% SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.13
0.25
0.38
0.50
0.63
0.75
1.0
1.25
10% SDS
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
TEMED
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.008
0.01
5
10
15
20
25
30
40
50
10%胶
水
1.9
4.0
5.9
7.9
9.9
11.9
15.9
19.8
30%丙烯酰胺混合液
1.7
3.3
5.0
6.7
8.3
10.0
13.3
16.7
1.5mol/L Tris(pH8.8)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10% SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
溴酚兰0.02g
双蒸水0.5 mL
室温存放备用
考马斯亮蓝染色液
考马斯亮蓝R-250（G-250）1.0 g
甲醇450mL
冰醋酸100mL
ddH2O450mL
0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用
考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）
甲醇100mL
C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。
D液——10％SDS：10g(2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。
E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
表1.配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
成分
配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/mL
SDS-PAGE电泳所用溶液：
30%聚丙烯酰胺溶液(100 mL)
丙烯酰胺(Arc)29 g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis)1 g
用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放
丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
0.012
0.016
0.02
表2.配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液
成分
配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/ml
1
2
3
4
5
6
8
10
水
0.68
1.4
2.1
2.7
3.4
4.1
5.5
6.8
30%丙烯酰胺混合液
0.17
0.33
5
0.67
0.83
1.0
1.3
1.7
1.5mol/L Tris(pH6.8)
5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)
Tris碱15.1 g
甘氨酸(电泳级)94 g
10%SDS50mL
使用时稀释5倍使用
2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)
0.5 mol/LTris-Cl (pH 6.8)2 mL
10％(W/V)SDS4mL
甘油2 mL
β-巯基乙醇1.0 mL
(DTT（二硫苏糖醇）0.31g)