甾体激素类药物分析讲座
（二）UV法
△４-3-酮 240nm（±） 肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素、口服避孕药 280nm（±）
雌激素
苯环
示例：醋酸地塞米松片的含量测定 （1）配制供试液 （2）测定240nm的吸光度 （3）按 为357计算
醋酸地塞米松的 紫外吸收光谱
具体操作及计算：
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当
（三）比色法
1. 异烟肼比色法
C3－酮基
肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素
异烟腙（黄）
（1） 原理
C 酮基
异烟肼
HCl （缩合）
OH
CONHN
N
异烟腙（黄色）
（2）方法 对照品法
供试液
挥去乙醇 CHCl 异烟肼 ℃
对照液
A
暗45min
（3）讨论
A. 反应专属性：具有△4 – 3 – 酮基的甾体激 素在室温不到1h即可定量的与异烟肼反应， 本法对△4 – 3 – 酮基具有一定的专属性。
无水乙醇10ml
样品液
强力振摇
冰浴静置分层，取上 层离心，上清液作为 供试品液
对照液 另取丙酸睾 酮对照品
无水乙醇
制备1mg/ml的对照溶液
2、色谱条件 薄层板：硅胶GF254 点 样：样品液和对照液各10l 展开剂：二氯甲烷-甲醇（19∶0.5） 检测：在254nm的紫外灯下检视 3、判断：以Rf值定性。
醋酸地塞米松
肾上腺皮质激素
OH O OH CH 3 H OH H
H
CH 3 H F O
曲安息龙
肾上腺皮质激素
H O CH 3 ONa O OH H OH H P ONa O
HO
CH 3 H F O
地塞米松磷酸钠
雄性激素
CH 3 CH 3 H H O H OH CH 3
甲睾酮
雄性激素
O O H H H O H CH3
2、色谱条件 薄层板：硅胶G 点 样：样品液和对照液各5l 展开剂：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385∶60∶15∶2） 显色剂：碱性四氮唑蓝试液 3、判断 样品液主斑点的颜色及位置应该与对照液主斑点相同。
对照液
Another example: 丙酸睾酮注射液的鉴别
1、溶液的配制 取本品约相当于丙 酸睾酮10mg
C3-酮基＞ C20-酮基、C17-酮基 C11-酮基不反应
B. 溶剂的选择
异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇
C.水分、温度、O2与光线的影响
含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓ 溶剂不挥发、不吸收水分时→ O2与光线无影响
R OCOCH
醇制KOH
H SO
C HOH
香
CH CH OCOCH
特臭
戊酸雌二醇 戊酸 H
己酸羟孕酮 己酸
H
特臭
醇制NaOH
醇制OH
二、鉴别试验 （一）与强酸的呈色反应 （母核）
H SO H PO 2 4 3 4 甾体激素 呈色 HClO4 HCl 类药物
四氮唑盐
OHˉ
呈色
2.C3–酮基和C20–酮基 甾酮类激 素药物
羰基试剂
呈色
＃常用的羰基试剂：
2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼
For example：
OH
CONHNH 2
N HCl
OH
O
睾酮
CONHN
N
异烟腙（黄色）
CH 3
CONHNH 2
2
黄体酮
C O
N HCl
CH 3
O
C NHNOC
N CONHN
红色偶 氮染料
6. 乙炔基的沉淀反应
含炔基 的甾体 激素
R C CH
硝酸银
银盐沉淀
AgNO3
R C CAg↓
炔雌醇
OH C CH
HO
AgNO 3
OH C CAg
白
HO
(三)制备衍生物测定m.p.
缩氨基脲的生成
苯丙酸诺龙50mg
甲醇2 ml溶解 盐酸氨基脲4ml，30min
水浴上浓缩， 冷却，滤过
苯环的骨 架振动
ν OH
酚羟基
ν
炔基伸缩振动 -1 3300cm OH
黄体酮
H H O H
CH3 C O
结构特征：△４-3-酮、C17-酮基
位酮基 20 C=O
1700cm1870cm-1 C NhomakorabeaH 双键
1615cm1
1665cm-1 3位酮基
（七）TLC法
主要用于甾体激素类药物 制剂的鉴别
醛、酮与2，4-二硝基苯肼作 用生成的2，4-二硝基苯腙是黄色 结晶，具有一定的熔点，反应也 很明显，便于观察，所以常被用 来鉴别醛、酮。其它反应的产物 肟、腙大都也是具有一定熔点的 晶体，亦可用来鉴别醛、酮。因 此，把这些氨的衍生物称为羰基 试剂（即检验羰基的试剂）。
2.
雄性激素及蛋白同化激素
丙酸睾酮
蛋白同化激素
O O H H H O H
苯丙酸诺龙
孕激素
O CH 3 CH 3 H H O H CH 3 H
黄体酮
孕激素
O CH 3 CH 3 H H O CH 3 H CH 3 O O CH 3
醋酸甲地孕酮
雌性激素
CH 3 H H HO H H OH
雌二醇
雌性激素
CH 3 H H HO H OH C CH
性 质
主要活性基团
△4 – 3 – 酮
UV、与羰基试 剂反应 可成酯
C17 – β – 羟基
3.
孕激素
性 质
主要活性基团
△4 – 3 – 酮
UV、与羰基试 剂反应
C17 –甲酮基
与亚硝基铁氰 化钠反应
4. 雌性激素
主要活性基团 性 质
UV、与重氮苯磺 A环为3–OH 苯环 酸盐反应 C17 –乙炔基 C17 –羟基 与AgNO3反应 可成酯
与硫酸显色反应
药品名称 醋酸可的松 显 色 荧光 加水稀释后 褪色并澄清 絮状↓玫红 ↓红色 黄→蓝绿 黄或微 带橙色 橙红 橙红 橙色 黄绿 黄绿
炔雌醇 炔雌醚 泼尼松
泼尼松龙
深红
红色消失 灰色絮状↓
(二 )
官能团的反应
1、C17 – α – 醇酮基 呈色反应 肾上腺 皮质激 素药物
还原性
此外还有与斐林 试液、多伦试液 的沉淀反应
方法：对照品法
要求供试品溶液所显主斑点 的颜色和位置与对照品溶液的主 斑点相同。
For example: 醋酸泼尼松片的鉴别
1、溶液的配制
样品
相当于0.1g的醋 酸泼尼松的片粉
CHCl 3 50ml 过滤 滤液作样品液 样品液
溶解
CHCl 3 醋酸泼尼松对照品 2mg/ml
检查方法：
TLC法（高低浓度对比法）
HPLC法（类似高低浓度对比法）
（1）TLC法（高低浓度对比法）
判定方法：
规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色
例：氢化可的松中其他甾体的检查
供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml 对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60μg/ml 层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出。
判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜
色与对照液的主斑点比较，不得更深。
例：醋酸氟轻松中其他甾体的检查
取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml作为供试 液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml 作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G 板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在 105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视， 供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的 主斑点比较，不得更深。
于醋酸地塞米松7.5 mg），置100 ml量瓶中，加乙醇75 ml，
置50 ℃ ~ 60℃的水浴中保温10min，时时振摇使溶解，放 冷至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤
液20 ml，置另一100 ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，在
240 nm的波长处测定吸收度，按C24H31FO6的吸收系数 为357计算，即得。
O
蓝紫色
4.有机卤素
呈色
茜素氟蓝 硝酸亚铈 有机氟 有机氯 硝酸—硝酸银 有机破坏 Fˉ Clˉ
AgCl↓
O
OH OH
茜素氟蓝
CH2COOH CH2N
O
CH 2COOH
F- Ce
O OH O CH 2 COO CH 2N O CH 2COO Ce F OH
蓝紫色
5. 酚羟基
雌激素 重氮苯磺酸 类药物
磷钼酸蓝：740nm
对照液：同上
四、含量测定
(一)、HPLC法 USP、BP、JP均采用 RP－HPLC（大多内标法） 甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂 质，对利用结构特征设计的比色法有干扰 测定对象： 甾体激素类药物的原料和制剂。
示例：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相：ODS，流动相 甲醇-水 （65:35），检测波长254nm， 内标物 己烯雌酚 系统适用性试验：N > 1000，R符合规定。
沉淀用甲醇洗，水 洗，105 ℃干燥
缩氨基脲衍生物
m.p.约182℃
（四）UV法
1. 结构依据
４ △ -3-酮、苯环、其他共轭结构
240nm左右
280nm左右
2. 应用示例
曲安西龙 溶剂 浓度 甲醇 丙酸倍氯米松 乙醇
第10章 甾体激素类药物的分析 PPT课件
原理：磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，再被1-氨基-2 －萘酚-4-磺酸溶液还原，所得磷钼酸蓝在740nm有最大吸收。比较供试 液与对照液的吸收度控制药物中游离磷酸盐的量。
A B
6
9
C D
C 21 C
7、酯的反应
有些本类药物，在C17或C21位上连接有酯基，可将 其水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质进行鉴别 (如醋酸泼尼松，己酸羟孕酮等)。 醋酸,在酸性条件 下与乙醇生成醋 酸乙酯，有香气 己酸，有特臭
17
C D A B
2019/3/3
12
部分本类药物用测定衍生物熔点的方法进行鉴别 1、缩氨基脲的生成 C3位的羰基和氨基脲发生缩合，生成缩氨基脲，可测定其熔点，对 药物进行鉴别。 COCl 如苯丙酸诺龙，产物熔点约为 182℃，熔融同时分解。 CH3 CH3 2、酯的水解 O KOH + +KCl+H2O C O C N OH C HO 若结构是有机酸的酯，可水解后测定产物熔点。 O 如丙酸睾酮C17位是丙酸和睾酮形成的酯，碱性水解后得到睾酮， NH +2HO +2H2O 熔点应为150~156 ℃。 2 m.p.201℃ 炔雌醇 3、酯的生成 O N 某些药物有羟基，可与酰卤生成酯，可测定酯的熔点进行鉴别。 HO 双肟m.p.238℃ 如炔雌醇 C3位上的羟基与苯甲酰氯成酯后，熔点为 200~202℃。 黄体酮 4、酮肟的生成 有些药物C3位的羰基可与羟胺形成肟，可测定肟的熔点对药物进行 鉴别。 如黄体酮与盐酸羟胺反应后生成黄体酮双肟，熔点为235~240℃。
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时间(min)
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22.2
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游离磷酸盐
药物分析 课件 甾体激素类药物的分析
3 致突变性评价
评估甾体激素类物质的致 突变性可以了解其对遗传 物质的影响。
结论
通过本课件学习，我们可以深入了解甾体激素类药物的分析方法和质量控制， 以及对其安全性进行评估的重要性。还可以展望甾体激素类药物未来的发展 趋势。
甾体激素类药物的分类及常用药物
类固醇
类固醇是甾体激素类药物的 重要一类，具有抗炎、免疫 调节等作用。
雄激素与雌激素
雄激素和雌激素是甾体激素 的两个主要类型，它们在生 殖和激素替代治疗中起着重 要作用。
肾上腺皮质激素
肾上腺皮质激素是甾体激素 类药物的另一类，常用于抗 炎、免疫调节和治疗肾上腺 功能不足。
甾体激素类药物的分析方法
1
化学方法
高效液相色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是甾体激素类药物分析的常用化学方 法。
2
生物方法
免疫分析法和生物反应器法是甾体激素类药物分析的重要生物方法。
甾体激素类药物的质量控制
1 纯度检测
甾体激素类药物的纯度可以通过物理性质分 析和化学性质检测进行评估。
2 含量测定
准确测定甾体激素类药物的含量是确保药物 质量重要步骤。
3 杂质检测
杂质检测有助于评估甾体激素类药物的纯度 和安全性。
4 物理和化学性质检测
通过物理性质和化学性质的检测，可以进一 步评估甾体激素类药物的质量。
甾体激素类物的安全性评价
1 急性毒性评价
评估甾体激素类药物的急 性毒性对于确保人体安全 至关重要。
2 慢性毒性评价
慢性毒性评价可以揭示甾 体激素类药物的长期使用 对人体的潜在危害。
药物分析 课件 甾体激素类药 物的分析
这是一份关于甾体激素类药物分析的课件。通过本课件，我们将深入探讨甾 体激素的概述、分类、分析方法、质量控制、安全性评价以及未来发展趋势。
甾体激素类药物的分析ppt课件 (2)
（二）官能团的反应
1. C17–α–醇酮基
A .呈色反应
强还原性
肾上腺皮质激素类药物特征反应
肾上腺皮质激素类 四 氮 药 唑 ,O盐 物 H呈色
26
醋酸泼尼松 ChP（2000） 【鉴别】 取本品1mg加乙醇2mL使溶
解，加10%氢氧化钠溶液2滴与氯化三
苯四氮唑试液1mL，即显红色。
27
一、化学鉴别法 （一）与强酸的呈色反应 母核的反应，机制不明 能与H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl等呈色。 最常用的是H2SO4。
甾体激素 类 H 2S 药 O 4 物呈2色 4
与硫酸显色反应
显色
荧光
醋酸可的松 黄或微带橙
炔雌醇
橙红
黄绿
炔雌醚 泼尼松
橙红 橙
黄绿
泼尼松龙 深红
加水稀释 褪色并澄清 玫瑰红絮状↓ 红色↓ 黄→蓝绿 灰色 絮状↓
ⅲ其它：10位、13位-甲基，11位羟基或羰基等 ⅳ人工合成品：1、2位间有双键，6位，9位
引入卤素，16位或16位引入甲基，16位引 入羟基等。
10
二、雄性激素与蛋白同化激素
OH Me
H
HH O
M eth yltesto ste ro ne
甲基睾酮
C17位加甲基作用更强
11
O
O
CH3
H H
HH
mg/mL作为供试液，精密量取适量，加氯
仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/mL作为对
照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于
同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）
为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分
钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即 检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得1 多
甾体激素类药物的鉴别讲议(给学生)
药物分析综合实验III甾体激素类药物的质量分析实验一TLC分离度与灵敏度实验1．案例某制剂厂生产了一批醋酸地塞米松片，质量管理部（QA）主任转告质量分析部（QC）主任当天完成本批药物的质量检验工作，为了尽快完成任务，QC主任将本批醋酸地塞米松的质量检验分别分配给本部的检验人员，假如你刚刚毕业就被分配在本岗位工作，且要求你使用薄层色谱法独立完成本批醋酸地塞米松的鉴别和杂质检查工作，你应该怎么办？2．本企业药品标准摘选（1）分离度实验取本品细粉适量,用甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液,滤过,作为供试品溶液；取醋酸地塞米松对照品,同样用甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液,作为对照品溶液。
照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各2μl,点于同一硅胶GF254薄层板上;另取乙酸乙酯-石油醚-丙酮（5∶8∶0.5）为展开剂,展开后,晾干,紫外灯下检视。
醋酸地塞米松结构：要求：Rf值在0.2~0.8之间，如果存在地塞米松杂质要求二者分离度大于1 （2）灵敏度实验取醋酸地塞米松对照品,用甲醇制成每1ml含0.2mg、0.1mg、0.05mg、0.025mg 的溶液, 吸取上述两种溶液各2μl,点于同一硅胶GF254薄层板上;另取乙酸乙酯-石油醚-丙酮（5∶8∶0.5）为展开剂,展开后,晾干,紫外灯下检视。
找出能观察到斑点的最低浓度值。
即为其检测灵敏度。
3．实验目的3.1 掌握薄层色谱法的基本操作与原理；3.2 熟悉薄层色谱法分离度和灵敏度的操作方法；3.3了解醋酸地塞米松合成路线与醋酸地塞米松片制剂组成。
4．思考题4.1 药品标准的理论依据①薄层色谱法的分离机制主要包括四种，在本实验中所采用的是哪种分离机制？使用薄层色谱法鉴别醋酸地塞米松片的理论依据？②斑点的确定方法有哪些？本实验中使用哪种方法？③薄层色谱法常用的硅胶有哪些种？本试验中为何使用硅胶GF254薄层板？④展开剂的选择原则是什么？⑤除了样品本身的性质之外，影响Rf值的因素有哪些？⑥Rf值与Rs（相对比移值）有何不同？4.2 仪器与试药①本试验将使用的主要仪器？②本试验测定的样品与主要试剂？4.3 操作注意事项①薄层板的铺制方法？②薄层板为何需活化，什么是“活化”？③展开剂的用量应为多少？④展开之前为何需将展开剂在层析缸内预饱和？饱和多长时间？⑤什么是“边缘效应”？⑥对样品点样的要求有哪些？4.4 讨论①本试验中在配制样品时为何需要过滤？②样品中醋酸地塞米松与杂质之间的分离度怎样计算？实验二TLC与TLCS鉴别醋酸地塞米松片1．案例某制剂厂生产了一批醋酸地塞米松片，质量管理部（QA）主任转告质量分析部（QC）主任当天完成本批药物的质量检验工作，为了尽快完成任务，QC主任将本批醋酸地塞米松的质量检验分别分配给本部的检验人员，假如你刚刚毕业就被分配在本岗位工作，且要求你使用薄层色谱法与薄层色谱扫描法独立完成本批醋酸地塞米松的鉴别工作，你应该怎么办？2．本企业药品标准摘选（1）薄层层析条件薄层板：硅胶GF254展开剂：乙酸乙酯-石油醚-丙酮（5∶8∶0.5）；展开方式：上行法；层析温度：室温；展开距离：10 cm；显色方法：紫外灯照射（2）薄层扫描条件扫描方式：单波长法；测定波长：254nm。
甾体激素类药物的分析详解
加速试验
在超常条件下进行加速试验，以 预测甾体激素类药物在短时间内 的稳定性。
长期试验
在接近实际储存条件下进行长期 试验，以确定甾体激素类药物的 有效期和储存条件。
05 甾体激素类药物的生物 活性评价
细胞水平评价方法
细胞增殖实验
通过检测药物对细胞增殖的影响，评估药物的抗增殖 或促增殖活性。
细胞凋亡实验
03 样品前处理技术
提取与纯化方法
液-液萃取法
利用样品与提取剂之间的溶解度 差异，将目标物从样品中提取出 来。常用的提取剂包括有机溶剂
、酸、碱等。
固相萃取法
利用固体吸附剂对样品中的目标 物进行选择性吸附，然后用适当 的溶剂洗脱，达到分离和纯化的 目的。常用的吸附剂包括硅胶、
氧化铝、活性炭等。
超临界流体萃取法
人体试验评价方法
临床试验
在人体中进行的药物疗效和安全性评价，包括I 期至IV期的临床试验。
生物等效性试验
比较创新药物与已上市药物的生物利用度和药 代动力学参数，以评估其生物等效性。
药物相互作用研究
探讨药物与其他药物或食物之间的相互作用，以指导合理用药。
06 甾体激素类药物的代谢 与排泄研究
吸收、分布和代谢过程
02 甾体激素类药物的分析 方法
色谱法
薄层色谱法（TLC）
利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数不同，实现对甾体激素类药物的分离和鉴别。该方法具有操作简 便、快速、成本低等优点，但分辨率和灵敏度相对较低。
高效液相色谱法（HPLC）
采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂等流动相泵入装有固定相的色谱柱，实现 对甾体激素类药物的分离和分析。该方法具有高分辨率、高灵敏度、分析速度快等优点，广泛应用于甾体激素类 药物的含量测定和有关物质检查。
药物分析讲稿-第十二章 甾体激素类药物的分析
药物分析讲稿-第十二章甾体激素类药物的分析第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松第十二章甾体激素类药物的分析第一节基本结构与分类甾体激素类药物是一类具有甾体结构的激素类药物，是临床上一类较为重要的药物。
甾体激素类药物种类较多，但基本骨架相同，均具有环戊烷并多氢菲的母核。
其基本骨架及位次编号如下:甾体激素类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，性激素又分为雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素及孕激素等。
一、甾体激素类药物的类型及结构特征大多数甾体激素类药物是由雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素及肾上腺皮质激素的基本结构衍生而来的。
(一)雌性激素天然的雌性激素为雌二醇，结构如下:对雌二醇进行结构改造，得到一系列高效、长效的雌激素类药物。
《中国药典》收载的雌激素类药物有雌二醇(estradiol)、炔雌醇(ethinylestradiol)、炔雌醚(quinestrol)、戊酸雌二醇(estradiol valemte)、苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate)等。
雌激素类药物的母核有18个碳原子，A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有β-羟基，有些药物的C17-羟基形成了酯，有的药物C17位上有乙炔基(如炔雌醇)。
(二)雄性激素和蛋白同化激素天然的雄性激素为睾酮。
结构如下:雄性激素类药物的母核有19个碳原子，蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基，其母核只有18个碳原子。
A环上有?4-3-酮基，形成共轭体系，具有紫外吸收;C17位有β-羟基或由它们形成的酯(如丙酸睾酮)。
《中国药典》收载的该类药物有丙酸睾酮(testosterone propionate)、甲睾酮(methyl-testosterone)、苯丙酸诺龙(rmndrolone phenylpropionate)等。
第 1 页共 9 页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松(三)孕激素天然的孕激素为黄体酮，结构如下:孕激素类药物的母核有21个碳原子，A环有?4-3-酮基;C17位有甲酮基;有的药物C17位有α-羟基或与酸形成的酯，还有的具有乙炔基。