酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较汇编
浅谈心肌细胞培养技术及其进展
浅谈心肌细胞培养技术及其进展作者：陈阜绪宋洁来源：《医学信息》2016年第23期摘要：细胞培养技术是生物医学研究中最常用和最重要的技术之一，本文就心肌细胞的经典培养模型和新进展作一综述。
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。
因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。
在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。
细胞培养（cell culture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。
可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。
本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌细胞（adult cardiomyocyte，ACM）两种。
ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。
ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d内的乳鼠心室肌细胞最常用。
心脏内皮细胞的分离_概述说明以及解释
心脏内皮细胞的分离概述说明以及解释1. 引言1.1 概述心脏内皮细胞是构成心脏血管系统的重要组成部分，具有维持血管结构稳定、调节血压和参与免疫反应等多种功能。
因此，研究心脏内皮细胞的分离方法对于心血管疾病的诊断、治疗以及药物筛选等方面具有重要意义。
本文旨在概述并解释心脏内皮细胞的分离方法，包括定义和功能介绍、分离方法的概述以及它们之间的优劣比较。
此外，我们还将详细讨论心脏内皮细胞分离过程中的步骤和操作技巧，如材料准备、操作环境要求、细胞分离酶选择与使用方法以及培养基配制与使用注意事项等。
在实验结果和数据解读部分，我们将介绍心脏内皮细胞分离后效率和纯度评估指标，并展示实验结果并进行详尽解读。
此外，我们还会将结果与预期进行比较，并探讨其与现有研究进展之间的联系。
最后，在结论与未来展望部分，我们将总结心脏内皮细胞分离方法的优缺点，并探讨其在心脏内皮细胞研究中的潜在应用前景。
同时，我们还会提出该领域研究进一步发展的方向和探索的方向。
通过本文的阐述，希望能够为研究人员提供有关心脏内皮细胞分离方法的全面指导，促进对心脏内皮细胞功能和相关疾病机制的深入理解，并为相关治疗方法的开发和改进提供新思路。
2. 心脏内皮细胞的分离：心脏内皮细胞是一种位于血管内壁上的细胞，其主要功能包括调节血管张力、维持心脏功能和参与免疫反应等。
在很多研究中都需要对心脏内皮细胞进行分离以便进一步的实验操作和研究。
本部分将概述心脏内皮细胞的定义和功能，并对常用的心脏内皮细胞分离方法进行简要介绍，并对这些方法进行优劣比较。
2.1 心脏内皮细胞的定义和功能：心脏内皮细胞是一种存在于血管壁以及相关组织中的特化上皮细胞，其具有重要的生理功能。
首先，它们构成了血管内壁，起到隔离并调控外部环境与体液之间物质交换的作用。
其次，心脏内皮细胞可以通过释放各种生物活性物质来参与调节血管张力，因此在血压控制和循环系统平衡方面发挥着关键作用。
此外，它们还可以通过分泌细胞外基质和参与免疫反应等方式对心脏功能进行支持和调节。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较_NormalPdf
中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(8)两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较曹卉1，王薇2，肖敬川1，黄邓高1，高元慧1，朱丹1（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室，海口570208；2.中南大学湘雅医学院附属海口医院皮肤科，海口570208）[摘要]目的：作为理想的种子细胞，成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。
本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method ，ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method ，EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts ，HFF)，以探讨两种方法的优缺点。
方法：ITCM 是将剪碎的皮肤组织置0.1%II 型胶原酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15min ，待组织块贴壁于培养皿后进行培养。
EDM 是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，将真皮组织再次于4℃下用0.1%II 型胶原酶消化过夜，然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压，用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网，对得到的细胞悬液进行培养。
ITCM 与EDM 均采用两种酶进行消化，但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同，最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。
本研究利用ITCM 和EDM 分离、培养HFF ，观察ITCM 组和EDM 组HFF 的原代至第3代(Passage 0~Passage 3，P0~P3)的细胞形态；染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度；绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。
采取120mJ/cm 2的中波紫外线(medium-wave ultraviolet ，UVB)照射P3ITCM 组和EDM 组HFF ，建立光损伤模型。
成肌细胞原代培养及临床应用前景
成肌细胞原代培养及临床应用前景邱裕佳;王伟【摘要】成肌细胞(Myoblast)是肌组织中静止的单核细胞,肌纤维肌膜与基底膜之间,是肌细胞的前体细胞,在肌肉损伤修复过程中发挥重要作用.随着分子及细胞生物学的发展成肌细胞的特性逐渐被人们认识,如取材方便、来源广泛、体外增殖分化能力强、能与受体肌细胞融合并共享基因产物、移植后不会无限增殖或形成肿瘤、自体成肌细胞移植没有伦理争议等,因而成肌细胞被视为优良的种子细胞被应用于多种系统相关疾病的研究和治疗中.文章针对成肌细胞的原代分离、纯化、影响其增殖及分化因素、成肌细胞的临床应用前景等方面作以概述.%Myoblast,mononuclear quiescent cells in muscle tissue,located between sarcolemma and basement membrane,the precursor cell of muscle cell,plays an important role in the repair process of damaged muscle.With the development of molecular biology and cell biology,pecu-liarities of myoblast were further discovered,such as easy accessibility,wide source,strong ability of proliferation and differentiation in vitro,fusion with receptor muscle cells and share gene products,without unlimited proliferation and tumor formationafter implantation,autologous myoblast transplantation would not cause ethical controversy.Therefore myoblast is regarded as excellent seed cells to be used in the study and treatment of many kinds of system related diseases.This article provides a summary concentrate on the primary myoblast isolation,purification,factors affecting the proliferation and differentiation,and the prospects of the clinical application.【期刊名称】《生物骨科材料与临床研究》【年(卷),期】2017(014)002【总页数】4页(P72-75)【关键词】成肌细胞;原代培养;细胞治疗【作者】邱裕佳;王伟【作者单位】锦州医科大学研究生院辽宁锦州121000;锦州医科大学骨外科学研究所辽宁锦州121000;锦州医科大学辽宁省医学组织工程重点实验室辽宁锦州121000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1成肌细胞是骨骼肌中具有增殖分化潜能的成体干细胞，由Muaor（1961年）首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出来。
两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较
两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较目的比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。
方法滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。
采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS 进行鉴定。
结果2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。
传代可使FLS 达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征，流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性，CD55呈弱阳性。
组织块法培养法FLS成功率较高，细胞游出时间较早，细胞损伤小。
结论组织块培养法适合于FLS的培养，第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。
[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis類风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病[1]。
心肌细胞培养
乳鼠心肌细胞培养经验谈1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：胰酶＋胶原酶II混合消化的方法,并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。
还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2。
5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
经验一：总结来说:1。
0.08%胶原酶II＋0。
125%胰酶等比混合后消化2.消化前后一定要轻柔吹打3.重悬时要充分吹打,动作轻柔（100次）4。
种板密度要合适5.当然血清,板都要进口，别图便宜6.别忘了检查CO2温箱的情况2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧,或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。
经验二:1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的,活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的,再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。
2：胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了，处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5％血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。
离心1000转4分钟.3：四季清的胎牛血清,180元一瓶，很便宜，进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱，我建议用进口的。
我们用的是15%的浓度。
（注意:终止液和培养液浓度是不同的，终止液没必要用那么高浓度，有点浪费）,我们用高糖的DMEM，感觉不错。
在这里我感觉最重要的培养液的PH 值，尽量在7。
2—7。
4之间,刚开始我们还有仪器测，后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调，大部是高，没有低的。
流式细胞术实验方法及应用
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
FSC
SSC
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，
散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
细胞群周期与DNA倍
体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
GG22//MM
(4(4CC) )
三个细胞峰。
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇 4ºC ，24h 离心去固定液 PBS洗2次 RNase
30min PBS洗1次
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
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中国组织工程研究 第20卷 第50期 2016–12–02出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 2, 2016 Vol.20, No.50·研究原著·www.CRTER .org李沙，女，1986年生，河北省邯郸县人，汉族，河北医科大学在读硕士，主要从事心血管病研究。
通讯作者：李树仁，博士，教授，主任医师，硕士生导师，河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)50-07565-06 稿件接受：2016-10-17实验组：1 mm 3的组织块经0.25%胰酶/0.02% EDTA 消化后直接培养。
对照组：1 mm 3的组织块经0.25%胰酶/0.02%EDTA 消化，过筛网去除体积>1 μm 3的组织块。
1.观察第1代细胞生长状况；2.免疫荧光鉴定第1代心肌干细胞；3.计数第1代细胞中心肌干细胞百分比；4.流式细胞术分析心肌干细胞百分比。
原代培养10 d 后进行传代，选第1代细胞，收集指标。
40只1 d 龄大鼠随机分两组，取心脏酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较李 沙，李树仁，郝清卿，杨玲玲，张倩辉，马玉龙，张跃华，邓文浩(河北医科大学附属河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051)引用本文：李沙，李树仁，郝清卿，杨玲玲，张倩辉，马玉龙，张跃华，邓文浩. 酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较[J].中国组织工程研究，2016，20(50):7565-7570.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.017 ORCID: 0000-0002-0031-2819(李树仁)文章快速阅读：文题释义：心肌干细胞：成年哺乳动物心脏内存在心肌干细胞巢，在心房和心尖部位分布较多，心肌干细胞除存在于心肌干细胞巢外，也有少数分散在心肌中，心脏受到损伤刺激后，能够迅速向损伤部位迁移、分化产生心肌细胞。
心肌干细胞的主要生物学特性包括：①克隆能力；②有多能性和能够自我更新；③能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞；④可在损伤心肌局部激活、迁移。
免疫细胞化学：又称免疫组织化学，其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，经过化学的呈色反应后，用显微镜或电子显微镜观察。
摘要背景：目前国内动物研究中提取心肌干细胞方法不统一，分离培养及提纯未形成规范化的流程。
目的：探讨酶消化法和组织块法培养大鼠心肌干细胞的差异。
方法：取清洁级1 d 龄SD 大鼠心脏组织，分为组织块组与酶消化组，分别使用酶消化法和组织块法体外培养心肌干细胞。
结果与结论：酶消化法和组织块法均能培养出心肌干细胞，但组织块组培养的细胞中心肌干细胞比例显著高于酶消化组。
提示在心肌干细胞培养过程中，组织块法优于酶消化法。
关键词：干细胞；培养；心肌干细胞；细胞培养；免疫荧光；流式细胞术；免疫组化；C-kit +心肌干细胞；河北省自然科学基金主题词：细胞培养技术；心肌；组织工程基金资助：河北省自然科学基金项目(C2015307019)Enzyme digestion method versus tissue block method in the culture of cardiac stem cellsLi Sha, Li Shu-ren, Hao Qing-qing, Yang Ling-ling, Zhang Qian-hui, Ma Yu-long, Zhang Yue-hua,Deng Wen-hao (Department of Cardiology, Hebei General Hospital Affiliated to Hebei Medical University,在心肌干细胞培养过程中，组织块法优于酶消化法Li Sha, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, Hebei General Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, ChinaCorresponding author:Li Shu-ren, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Cardiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: At present, various methods of extracting cardiac stem cells have been reported in China, but the processes of isolation, culture and purification are not yet standardized.OBJECTIVE: To explore the difference in the culture of rat cardiac stem cells using enzyme digestion method and tissue block method.METHODS: Cardiac stem cells from Sprague-Dawley rats, clean grade, 1 day of age, were extracted and cultured in vitro using the enzyme digestion method (control group) or tissue block method (experimental group).RESULTS AND CONCLUSION: Both of the two methods could produce cardiac stem cells, but the proportion of cultured cells in the experimental group was significantly higher than that in the control group, indicating the tissue block method is superior to the enzyme digestion method in the culture of cardiac stem cells.Subject headings: Cell Culture Techniques; Myocardium; Tissue EngineeringFunding: the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. C2015307019Cite this article: Li S, Li SR, Hao QQ, Yang LL, Zhang QH, Ma YL, Zhang YH, Deng WH.Enzyme digestion method versus tissue block method in the culture of cardiac stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7565-7570.0 引言Introduction心肌干细胞是一定条件下能够分化为各种心肌细胞的未分化细胞，且c-kit+细胞是心肌组织中含量最多的干细胞类型。
近年来，心肌干细胞Ⅰ期临床试验，二者均证实心肌干细胞移植治疗心肌梗死是安全可行的[1-2]，且急性心肌梗死患者在接受移植心肌干细胞后，心肌梗死面积减少、心功能得以改善，2年随访结束时，患者也未出现严重不良反应[1]。
与此同时Doppler等[3]报道心肌干细胞的主要生物学特性包括克隆能力；能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞。
可见，心肌细胞为心肌梗死后缺血性心力衰竭的治疗开辟了新的途径。
但是，目前国内动物研究中发现心肌干细胞提取方法不统一[4-6]，心脏中存在心肌干细胞数量极少，心肌干细胞的分离培养及提纯仍未形成规范化的流程[7]。
因此，找到一种能够简单高效获取心肌干细胞的方法显得尤为迫切。
作者拟就心肌干细胞常用的组织块和酶消化培养法是否存在差别进行探讨。
1材料和方法Materials and methods1.1 设计随机对照细胞学研究。
1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年3月在河北医科大学附属河北省人民医院实验室完成。
1.3 材料实验动物：40只清洁级出生1 d龄SD大鼠，由河北医科大学动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2008-1-03。
主要试剂和仪器：IMDM培养基购自gibco公司；胎牛血清购自wesent公司；青霉素、链霉素由河北省人民医院提供；胰蛋白酶购自北京索来宝公司；抗c-kit抗体购自abcam公司；DAPI溶液购自北京索来宝公司；FITC 标记的链亲和素购自Life Technologies公司；100目不锈钢筛网购自上海易佰聚生物公司；生物安全柜购自Heal 公司；倒置显微镜购自Olympus公司；荧光显微镜购自德国Leica公司)；超净工作台购自日本Sanyo公司；5810R型台式多功能高速冷冻离心机购自eppendorf AG公司；细胞培养箱购自德国Heraeus公司。
1.4 方法1.4.1 组织块法取清洁级1 d龄SD大鼠，皮肤消毒后直接开胸取心脏，含1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的PBS洗2次，去除包膜及其他组织。
眼科剪剪切至小于1 mm3，吸管反复吹打分散组织细胞，PBS洗2次，弃上清，加入无钙镁0.25%胰酶/0.02% EDTA，37 ℃震荡消化10 min，1 000 r/min离心5 min。
弃上清，加入含10%胎牛血清的IMDM培养液，37 ℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度下培养。
裸眼观察培养液颜色，每2或3 d更换培养液1次。
倒置显微镜下每日观察细胞形态和贴壁生长[8]。