贴壁细胞的消化方法
叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。
贴壁细胞收集方法
贴壁细胞收集方法嘿，咱今儿就来讲讲贴壁细胞收集方法这档子事儿。
你可别小瞧了这收集贴壁细胞，就好像咱要从那墙上把宝贝给抠下来一样，得有技巧，有门道呢！想象一下，那贴壁细胞就像是一群调皮的小孩子，紧紧地贴在墙上不愿意下来。
那咱得想办法哄着它们下来呀！一般来说呢，最常用的就是胰蛋白酶消化法啦。
就好比给那些小家伙们喂点好吃的，让它们松松口。
咱先把培养皿里的培养液倒掉，然后加上适量的胰蛋白酶，让它在那静置一会儿。
这时候啊，就像给那些贴壁细胞挠痒痒似的，它们慢慢就会松动啦。
等过一会儿，你就会看到细胞开始变圆，这就是它们准备好要离开那面“墙”啦。
接下来可就是关键时候咯，得赶紧把胰蛋白酶倒掉，可不能让它待太久，不然那些细胞可就要遭殃啦。
然后加上新鲜的培养液，温柔地吹打几下，把那些松动的细胞都给收集起来。
这过程就好像是轻轻地把宝贝们从墙上摘下来，放进小篮子里。
还有一种方法呢，就是用细胞刮刀。
这就像是拿个小铲子去把贴壁细胞给铲下来。
不过这个可得小心点哦，别太用力把细胞给弄伤了。
用细胞刮刀慢慢地在培养皿底部刮一刮，把那些贴壁细胞给弄下来，然后再收集起来。
哎呀，这收集贴壁细胞可不简单呢，就跟咱干一件精细活儿似的。
你得有耐心，还得细心，不然一个不小心就可能把细胞给搞坏啦。
咱得像对待宝贝一样对待这些贴壁细胞呀，它们可是很重要的呢！在收集的过程中，你还得时刻注意观察，看看细胞的状态。
要是发现有什么不对劲的地方，赶紧调整方法。
可别傻乎乎地一直按照老办法来，得灵活应变呀！这就跟咱过日子一样，得随机应变，不能死脑筋。
总之呢，贴壁细胞收集方法可得好好掌握，这可是细胞实验里很关键的一步呢。
咱得把这些方法都记在心里，用的时候才能得心应手。
别到时候手忙脚乱的，那可不行！所以啊，大家都要好好学，好好练，把这门技术给掌握好咯！这样咱才能在细胞研究的道路上越走越远，越走越顺呀！你们说是不是这个理儿？。
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
分子生物学与细胞生物学实验基本技术
分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。
但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。
用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。
（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
LO2细胞争议
LO2细胞争议形态特征：L - 02细胞建系鉴定于190年（叶秀珍等，190)。
该细胞是一株正常肝细胞系，具有典型的肝细胞形态学特征，可用于多种实验研究。
2）细胞传代：如果细胞密度达0%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，*脱落后吸出，在1000RPM条件下离心-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
PS：若收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右*培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过0%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。
若密度超过0%，可直接进行传代（方法同上）。
2、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含ml培养基的新皿中或者瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
DNA抽提方法
1，贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2，细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。
3，重复2。
4，加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。
5，加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴3h,6，用等体积的酚抽提一次，2500r/min 离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇=25:24:1）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相。
用等体积的(氯仿，异戊醇=24:1)抽提一次。
7，加入等体积的5mol/L 的LiCL,混匀，冰浴，10min.8， 2500r/min,离心10min. 转上清与一离心管中。
加入等体积的异丙醇。
室温10分钟。
9， 2500r/min,离心10min。
弃上清。
加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。
-20℃ 20分钟。
10， 12000r/min, 室温离心5分钟。
弃上清。
将DNA溶于适量TE中2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris （pH8.0） 100 mmol/LEDTA （pH 8.0） 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶 20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，-20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚，氯仿，异戊醇（25:24:1）。
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12-24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
胰酶消化贴壁细胞原理
胰酶消化贴壁细胞原理胰酶是一种重要的消化酶，它在人体消化过程中起到了关键作用。
胰酶主要由胰腺分泌，它能够帮助人体消化食物中的蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质。
而胰酶消化贴壁细胞则是指胰酶在消化过程中与肠道内的贴壁细胞发生作用的机制。
胰酶消化贴壁细胞的原理主要包括胰酶的合成、分泌和作用三个过程。
首先是胰酶的合成。
胰酶是由胰腺内的特殊细胞合成的。
这些细胞受到胃内食物的刺激后，通过胰腺神经末梢的刺激而开始合成和分泌胰酶。
合成的胰酶经过胰管进入小肠。
接下来是胰酶的分泌。
胰酶的分泌主要通过胰腺分泌液的产生和排泄来实现。
当胃内食物通过幽门进入小肠后，小肠壁上的细胞会分泌一种叫做胃腺素的物质，这种物质能够刺激胰腺分泌液的分泌。
胰腺分泌液中含有胰酶和其他消化酶，它们经过胰管进入小肠，与食物中的营养物质发生作用。
最后是胰酶的作用。
胰酶主要通过两种方式作用于贴壁细胞。
一种方式是直接作用，胰酶直接与贴壁细胞接触并发挥作用。
另一种方式是间接作用，胰酶作用于食物中的营养物质，将其分解为小分子物质后再与贴壁细胞发生作用。
胰酶对蛋白质的消化作用是最为重要的。
胰酶能够将蛋白质分解为多肽、肽和氨基酸等小分子物质，这些小分子物质能够被贴壁细胞吸收和利用。
胰酶还能够作用于脂肪，将脂肪分解为甘油和脂肪酸等物质，以便贴壁细胞吸收。
此外，胰酶还能够作用于碳水化合物，将其分解为糖类物质，供贴壁细胞吸收利用。
总的来说，胰酶消化贴壁细胞的原理是胰酶合成、分泌和作用三个过程的综合作用。
通过胰酶的作用，食物中的营养物质可以被分解为小分子物质，以便贴壁细胞吸收和利用。
胰酶消化贴壁细胞的过程是人体消化过程中不可或缺的一部分，它保证了人体能够获得所需的营养物质，维持正常的生理功能。
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贴壁细胞的消化方法介绍
日期：2012-05-11 来源：互联网
标签：贴壁细胞细胞消化方法
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摘要: 用得也是非常多。
一般浓度在0.02%左右。
作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。
注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。
因此，配制时应调节好酸碱度。
它不能被终和。
因此，消化下来的细胞要洗一遍。
一、酶消化法。
1、胰酶。
这是用得最多的。
一般浓度在0.25-0.5%。
作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。
0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。
终止是用血清。
主要作用于细胞间。
配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。
保存于-20度。
2、胶原酶。
这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。
这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。
中止同样是用血清。
二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。
1、EDTA。
用得也是非常多。
一般浓度在0.02%左右。
作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。
注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。
因此，配制时应调节好酸碱度。
它不能被终和。
因此，消化下来的细胞要洗一遍。
2、商品化的无酶消化液。
个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。
三、物理法。
直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。
四、冷冻法。
此方法仅能用于细胞传代时。
无法使组织上的细胞脱落下来。
本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。
优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。
特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。
不足是细胞常成小片脱落。
此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。
具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。
细胞消化难题：
1，先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀
2，成团、絮状：
消化液里加入edta可以减少细胞成团的现象，血清可以终止胰酶的作用，如果是进口血清的话也能终止edta的作用。
用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清终止，如果消化液中加入了edta的话，就要将消化液倒干净，如果细胞贴壁要求不是很严格的话，一般不需要进行离心。
鼻咽癌细胞。
这种细胞的贴壁能力很强，用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化
12~15min。
用PBS洗涤时要洗净残余的培养基，加入胰酶后在培养箱中消化(避免细胞室温下受损以及在此温度时胰酶活性最强)至细胞收缩变圆(可显微镜下观察)且有少许细胞脱落(有流下来的趋势)，随后立即弃去胰酶(如果脱落的细胞很多且需要大量细胞实验，则不能弃去胰酶)，加入培养基仔细吹打(不能用无血清培养基或者PBS替代，否则细胞聚集成团块或絮状)。
一般我都离心一次弃去上清(去除残留的胰酶及漂浮的死细胞或细胞碎片)。
消化过度
马上用培养基中和，用吸管吹打细胞，收集全部的细胞到以无菌的离心管中800RPM 3分钟。
弃上清，用全培重悬，换新的培养瓶继续培养!!状态不好的细胞在培养的过程中会死亡脱落，在换液的时候可以清除掉!!
贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：
一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代;二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。
但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。
一种简单的消化传代方法。
加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用(30s)，弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s(根据细胞消化的难易程度)，弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。
对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。
不用PBS也不用Hanks洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。
弃培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶(预热)总体积1/10v。
消化到有细胞脱落。
不过有人说EDTA对细胞不好，有证据吗?
培养的BASMC：倒掉旧培养液加入少量胰酶冲一下，倒掉再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml(25ml bottle)消化再加入适量新培养基中和，并分瓶这种方法简单、省事;效果很好并且不损失细胞!。