贴壁细胞培养步骤及注意事项
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
贴壁细胞传代培养操作步骤
贴壁细胞传代培养操作步骤作文一：给初学者的贴壁细胞传代培养操作指南亲爱的小伙伴们，今天咱们来聊聊贴壁细胞传代培养那些事儿。
想象一下，细胞就像一个个小小的居民，住在培养皿这个“小区”里。
时间长了，“小区”变得拥挤，它们就需要搬家啦，这就是传代培养。
咱们得准备好工具，就像搬家要准备好箱子一样。
要有干净的培养皿、移液器、胰酶等等。
然后，把培养皿从培养箱里拿出来，在超净台里操作，可不能让细菌和灰尘这些“小捣蛋鬼”跑进去。
再加入胰酶，让细胞和培养皿分开，就像把粘在墙上的贴纸轻轻撕下来。
等细胞变圆了，赶紧加新的培养液终止胰酶的作用，不然细胞会受伤的哦。
用移液器把细胞吸出来，平均分到新的培养皿里，给它们新的“家”。
怎么样，是不是没有那么难？多练习几次，你就能熟练掌握啦！作文二：贴壁细胞传代培养，其实很简单朋友们，今天来和大家分享贴壁细胞传代培养的步骤，别害怕，一点都不难！比如说，我之前在实验室第一次做这个的时候，心里也直打鼓。
但做着做着就发现，真的没那么复杂。
咱们开始吧！先把要用的东西都准备好，像培养皿、移液器、胰酶，一个都不能少，这就好比做饭前要把食材和工具都摆好。
接着，把培养皿轻轻拿出来，动作要轻，不然细胞会被吓到的。
然后把里面的培养液吸掉，这就像给花浇水后把多余的水倒掉。
之后加入胰酶，等一会儿，你会看到细胞慢慢变圆，就好像它们在伸懒腰准备搬家。
这时，加新的培养液停止胰酶的作用，再把细胞吸出来，分到新的培养皿里，就大功告成啦！多试几次，你会发现自己越来越熟练，细胞在你的照顾下也会茁壮成长的！作文三：贴壁细胞传代培养，轻松上手小伙伴们，细胞传代培养听起来是不是很高深？其实很简单，跟我来！假设细胞是一群可爱的小朋友，在一个小小的教室里待久了，就得换个大点儿的教室，这就是传代培养。
第一步，把所有的“装备”都准备齐全，像新的培养皿、移液器，还有胰酶，这就像给小朋友们准备新的书包和文具。
第二步，把装着细胞的培养皿从“小房子”（培养箱）里拿出来，放在干净的“桌子”（超净台）上。
实用指导(二)：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤
实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤和元生物|2016-03-1513:51慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
以24孔为例：第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。
保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。
通常，24孔板内以5-8*10^4cells/孔的密度铺板。
第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量选择合适MOI值，进行病毒感染。
加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。
2弃去部分培养基将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。
3加入慢病毒加药量计算方法（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/mlPolybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。
5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。
如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。
弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。
细胞培养注意事项
细胞房操作注意事项1、细胞房实验耗材、仪器、药品等均不可随意带进或带出；2、严禁无关人员进入细胞房，如无特殊情况，每次进入细胞房不得超过2人，切勿带细胞房外人员进入细胞房；3、保持细胞房卫生，细胞房每两个星期打扫一次，需要清理的地方有：培养箱、无菌操作台以及一切操作皆有可能碰到的地方，清理时均需要用70%的酒精擦洗；地面也需要用70%的酒精擦洗，另外拖鞋、挂衣钩也需要用酒精擦洗。
配打扫用酒精用的大烧杯在细胞房水龙头旁边；4、每次处理细胞前、后均需要打扫无菌操作台；5、细胞房的任何药品均需标注详细，如名称、配制时间、配制人、浓度等各项指标，否则一律丢弃；6、培养基要分瓶使用，各用自己的培养基，以免交叉污染；7、不得随意使用、移动他人的细胞，如想使用，务必通知细胞持有人；8、细胞房用的物品进细胞房前均需要灭菌，常用的有：枪头、离心管、水、PBS，灭离心管的时候需要把离心管盖子一个一个的松开，灭水和PBS的时候一定要记得松开瓶口。
拿进细胞房之后要先放在细胞房用紫外照射灭菌后方可使用。
9、任何物品（药品、培养瓶等）进无菌操作台里都必须先喷酒精。
贴壁细胞培养方法细胞培养的一般步骤：实验复苏——培养——传代—冻存一、细胞复苏方法：1、先在细胞房准备好应当准备的，如清理好无菌操作台、培养基、一个装有9 ml 培养基的10 ml的离心管和37℃的水浴锅；2、从-80℃的冰箱里取出细胞，迅速到细胞房，然后打开棉花，然后快速的晃动冻存管，1分钟内必须全部溶化掉；3、将冻存管喷上酒精放进无菌操作台，手上喷好酒精，将手放进无菌操作台里，用枪将细胞转移至准备好的装有9 ml培养基的离心管里，盖紧盖子，用封口膜封好，放进离心机内离心，设定好转速（不同的细胞不一样，如：MCF-7的转速是800 RPM，所有细胞的转速均不要超过1000 RPM）和时间5分钟；4、取出细胞，喷上酒精，放进无菌操作台，手上喷上酒精，将上层清液倒掉，然后向离心管内加入1 ml新鲜培养基。
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击： 194次•MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
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贴壁细胞培养步骤
一、复苏
1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化
后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存
管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm
培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后
换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代
1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS
4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终
止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传
3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存
1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS
3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞
种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液
一、培养基配制
（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗
45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗
（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗
二、冻存液
90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇
三、消毒液
75%的酒精
注意事项
（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作
①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。
③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。
④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。
为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。
⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。
如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。
⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。
⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（2）细胞污染的预防
①实验用品防止污染。
细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。
操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。
②操作过程防止污染。
③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。
④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。
⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。
工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。
事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。
⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。
⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。
⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。
⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。
⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。
一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。
实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（3）防止细胞交叉污染
①进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。
按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生混乱。
②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。
③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。