贴壁细胞培养实验讲义
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO27天。
贴壁-悬浮培养
动物细胞培养的操作方式
• 1、分批式操作 • 一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进
行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和 积累，最后将条件培养基（conditioned medium），即经培养已含有细胞产物的培养基， 或连同细胞一并取出，培养结束。
• 另一种是先将细胞和培养 基加入反应器，待细胞生 长至一定密度后，向反应 器内加入诱导剂或病毒等， 经一端时间作用后，将反 应物取出，如产生Namalwa 干扰素和疫苗等。
• 80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。
• （2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在 凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合 成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、 纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种 生物反应器进行大规模培养。
• （3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再 用悬浮的方法培养，操作简培养）
（1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴 附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅 拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分 发挥悬浮培养的一切优点。
理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面 惰性、比重适当（1.030~1.045g/mL）、粒径均一， 在60~250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、 耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料 充分。
贴壁细胞chip实验原理及步骤-概述说明以及解释
贴壁细胞chip实验原理及步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以是关于贴壁细胞chip的基本介绍和背景信息。
可以参考以下示例进行编写：概述贴壁细胞chip是一种先进的实验平台，用于研究和观察贴壁细胞在特定环境下的行为和反应。
贴壁细胞是指能够附着在固体表面上生长和繁殖的细胞。
在许多生物学和医学研究中，贴壁细胞被广泛应用于细胞生物学、药物筛选、细胞力学以及组织工程等领域。
贴壁细胞chip的概念最早出现在上世纪80年代，其原理基于微流体技术和微型加工技术的结合。
利用微流体通道和微型孔洞，贴壁细胞可以被定向排列在特定位置，从而使得对于细胞的观察和实验更加精确和可控。
与传统细胞培养相比，贴壁细胞chip具有更高的细胞存活率和更好的细胞黏附性能。
贴壁细胞chip的制备需要一系列复杂的步骤和技术，包括微型加工、微流体控制、表面处理等。
通过精确控制微流体的流动和细胞的附着，研究人员可以模拟和重建生物体内的特定环境，以便更好地理解细胞在不同条件下的行为和反应。
贴壁细胞chip在各个领域都有广泛的应用。
在细胞生物学中，它可以用于观察细胞的形态学、生长动力学、迁移和侵袭能力等。
在药物筛选领域，贴壁细胞chip可以用于评估药物的毒性和疗效。
此外，贴壁细胞chip 还可以应用于细胞力学研究，如细胞的拉伸、压缩和应变等。
最近，贴壁细胞chip也被用于组织工程的研究，以构建和培养人工组织。
通过本文对贴壁细胞chip的原理和制备步骤进行详细介绍，希望能够提高读者对贴壁细胞chip的了解，并推动其在科学研究和医学应用中的发展。
同时，本文还将对实验原理的重要性、操作要点以及未来的发展方向等进行探讨和总结。
1.2 文章结构文章结构是指文章整体的组织方式和框架。
一个良好的文章结构可以使读者更好地理解和接受所传达的内容。
本文的结构分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分首先概述了贴壁细胞chip实验的背景和意义，引发读者对该实验的兴趣。
《细胞工程》实验三 贴壁细胞株的传代培养
谢 谢！
0.25g胰酶+100mlPBS+0.02gEDTA
4℃过夜溶解
超净台滤器除菌
0.25%胰酶（ 4℃保存，-20 ℃长期保存）
实验步骤：
弃去培养基，PBS洗2-3次
加胰酶（每瓶0.5ml左右，覆盖细胞即可）
消化适当时间，加完全培养基中和（与胰酶比例2:1）
吸取细胞悬液至离心管中
离心（1200转左右，3分钟）
弃去上液，加入新的培养基
成细胞悬液后，转移到培养瓶中
3. 细胞冻存与复苏
收集细胞时，除需用胰酶消化外，其它同悬浮细胞
4. 作 业
贴壁细胞培养的关键技术流程
4.常见问题
传代频率：每2-3天传代（至细胞长满至80%）
传代比率：1:6-1:8传代
消化条件：室温或者37℃
消化时间：依据不同细胞的贴壁牢固程度而不同 1.肉眼观察：细胞团的产生 2.显微镜观察：细胞变圆，部分漂浮 消化过度：传代后细胞不贴壁
贴壁细胞株的传代培养
贴壁细胞
细胞来源：人乳腺癌细胞：MCF-7
肿瘤相关成纤维细胞：CAF
1.培养条件
培养基：1640培养基（或DMEM）（含10%FBS）
PH： 7.2-7.4（可稍偏酸） 温度： 37℃
孵育箱
气体组成： 5%CO2+95%空气
2. 传 代
0.25%胰酶
配制方法：
细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
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细胞生物学实验讲稿 (20)
视频4.3 贴壁细胞的传代培养同学们好！贴壁细胞是必须附着在某一支持物表面才能生长的细胞。
传代培养则是分割细胞培养物进行的再培养。
可以进行细胞克隆，形成细胞株或提供大量一致、持久的实验材料。
实验原理：在贴壁细胞和培养瓶皿之间存在胞外蛋白形成的连接，适当的酶可分解这些胞外蛋白，使细胞得以与培养瓶、皿底部分开。
实验材料和用品：贴壁培养细胞样品，D-Hanks液，胰酶，完全培养液，培培养箱。
养瓶，一次性吸管，超净工作台，倒置显微镜，CO2实验操作环节：检查细胞——清洗细胞——加酶消化——终止消化——收集细胞——加液培养。
详细操作过程如下：培养箱里取出细胞培养瓶，先目测培养液的状况，判1、检查细胞：从CO2断是否染菌；然后用显微镜观察细胞生长状态及铺满度。
传代细胞应生长状态良好，铺满度一般达到80%~90%。
2、清洗细胞：在超净工作台内，将原有培养液倒掉；加入D-Hanks液，晃动培养瓶数次，弃D-Hanks缓冲液；重复洗涤1次，以尽量去除培养液中的血清成分与死亡细胞。
3、加酶消化：加入1mL酶液，晃动培养瓶使酶液覆盖培养物；倒掉；重新加入酶液覆盖细胞；拧好瓶盖，置倒置显微镜下监测消化过程；至细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形时即可终止消化。
如细胞贴壁牢固，可放置37℃培养箱内静置1min，再置倒置显微镜下观察。
4、终止消化：加入新鲜完全培养液，终止消化。
5、收集细胞：用吸管反复吸取培养液，有序地冲洗整个培养瓶皿底部，使细胞脱离瓶底并充分分散；显微观察细胞分散情况，如细胞成团，分散不充分，可在超净台内继续吹打至细胞完全分散。
将分散良好的细胞悬液转入离心管，1500 r/min离心5 min，沉淀细胞。
6、加液培养：吸弃上清，向细胞沉淀里加入适量新鲜完全培养液，用吸管吹打混匀细胞；等分到几个培养瓶皿中；补足培养液；做好标记；放置培养箱内培养。
注意事项1、严格避免微生物污染。
2、控制消化程度。
细胞贴壁生长实验报告
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
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贴壁细胞培养技术课讲义一、克隆形成及克隆形成抑制试验克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
平板克隆形成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
1.准备所需试剂及物品：①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组）②PBS③0.25%胰酶④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。
⑤甲醇：冰醋酸（3:1）⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可）⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC79012.操作：实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
第一天：⑪制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
具体操作如下：①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。
②加入1mlPBS稍摇动瓶，随即吸取弃之（不要直接冲洗细胞）③加入含10 % 血清RPMI-1640培养液6ml冲洗细胞（吸管，轻、均匀，一定要使瓶内细胞充分悬浮！！），再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
④根据计数结果，用10% 血清RPMI-1640培养液将瓶中细胞稀释约为4.0（左右）X 104cell/ml (15ml 离心管中) ，再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
注意：此为所有实验用细胞，保存好无污染！⑤取上细胞悬液稀释两次：取上面计数好的细胞悬液1ml至15mL离心管中，再加9ml 10% 血清RPMI-1640培养液，混匀后，再从此细胞悬液中取1ml 加入到小瓶中，加13 ml 15%血清RPMI-1640培养液（具体操作：先加12mL 10%RPMI-1640培养液，再加1ml的小牛血清）mix，充分悬浮。
此时约为300个细胞/ml，准备进行克隆形成实验。
⑫种板：12孔板，每孔用加样枪加 1 ml ⑤稀释好之细胞（注意：种板时要不时轻摇小瓶，适时吹打，保持细胞悬浮状态；种板时要轻缓，不要快速将细胞悬液注入孔中；种板后，不要摇动）。
放入5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育37℃过夜培养第二天实验前，操作台例行消毒（至少提前30分钟）⑬克隆形成及抑制实验①至培养箱中取出过夜培养之细胞，贴壁生长良好。
②加入药物，本实验为5-氟尿嘧啶。
设6组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育4天5-Fu 0 ~5μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为两个复孔，多计算一孔，每组试剂用量均*3（以免加量不准，多备）。
2组：5-Fu 30 ul + 培养液270 ul（10ul*3孔=30ul 90ul*3孔=270ul）3组：5-Fu 60 ul + 培养液240 ul4组：5-Fu 90 ul + 培养液210 ul5组：5-Fu 120 ul + 培养液180 ul6组：5-Fu 150 ul + 培养液150 ul混匀后每孔按分组加入100ul配制溶液。
③震荡混匀（加药后不要摇动）④放入CO2孵箱中继续培养4-5天（根据对照空细胞生长情况而定）第五或第六天⑭细胞固定（或省去该步骤）吸去培养液，加入PBS洗涤后，用甲醇:冰醋酸固定10 min。
⑮染色：刘氏染色法①加Liu A Solution (约0.5 ml~0.8 ml) 染色30 s。
②滴加Liu B Solution于A液上面(滴加量约为A液的两倍)，混合，染色1 min。
③水洗，干燥，镜检。
⑯倒置显微镜下计数细胞克隆(>20个细胞记一个克隆)并拍照。
克隆形成抑制率= (对照组细胞克隆数–实验组细胞克隆数)对照组细胞克隆数×100％。
二、MTT比色法MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm 波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，H3掺入法，LDH法有良好的相关性。
1.准备所需试剂及物品：①MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。
用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
②10 %新生牛血清的RPMI-1640，0.25%胰酶，DMSO（分析纯）③5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
④ 96孔板2.操作：实验所需时间4天实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
具体操作：2块96孔板，MTT与WST两方法同时做。
一块用MTT检测，一块用WST检测（方法基本同MTT法，见后）第一天①接种细胞，取上克隆形成实验④中计数好之细胞4 X 104cell/ml，每孔120 μL，接种到96孔板（为防止边缘效应，96孔板四周每孔加120uL 的PBS或生理盐水）。
每组3个复孔，分6组（见下表）。
每块板加18孔即可。
注意：保存细胞悬浮状态，以免时间过长细胞沉淀影响每孔细胞浓度。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育过夜第二天②加入药物40 ul/孔③药物浓度及配制5 – FU 约0——25 μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为三个复孔，多计算一孔（以免加量不准，多备）。
两块板（MTT与WST两法）一起配制。
2组：5-Fu 32 ul + 培养液288 ul（4ul*8孔=32ul 36ul*8孔=288ul）3组：5-Fu 48 ul + 培养液272 ul4组：5-Fu 96 ul + 培养液184 ul5组：5-Fu 192 ul + 培养液128 ul6组：5-Fu 288 ul + 培养液32 ul混匀后每孔按分组加入40ul配制溶液。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育培养48 h。
第四天④每孔加入MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4 h后。
小心吸弃孔内的上清液。
⑤每孔加入150 ul的DMSO，震荡10 min，酶标仪中570 nm 测吸光值。
注意事项：1.选择适当地的细胞接种浓度：一般情况下，96孔板孔内贴壁细胞长满时约有100,000个细胞，但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，进行MTT实验前，对每一种细胞都应测定贴壁率，倍增时间，以及接种细胞数条件下的生长曲线，然后测定实验中每孔接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满，保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
2.避免血清干扰。
呈色后，吸尽空内残存培养液。
否则影响显色。
三、Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂）WST法基本原理：该试剂中含有WST–8［其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐］，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢染料（Formazan dye）。
生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。
因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。
操作：同MTT同时操作取对数生长期的细胞，用含10 %新生牛血清的1640培养液调细胞浓度为4.2×104 cells/mL，每孔120 μL，接种到96孔板.置37 ºC、5 % CO2 孵箱中培养48 h，每孔加入WST试剂10 μL，继续孵育90 min，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度A450nm (激发波长450 nm，参比波长655 nm)，计算细胞的增殖抑制率。
（对照组呈粉红色）增殖抑制率=(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。