三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的机制探讨
三氧化二砷对K562及其多药耐药细胞系K562／A02细胞的诱导凋亡研究
Ｐ７ Ｉ０表达阳性 的 白血病 细胞 往往对 多种不 同化学 结 构 和作用靶点的药物 同时 发生而 药 。我们 观察 了三 氧化二 砷 寸 （ Ｏ ） Ａ ３ 对体外 培养 的人 急性红 白血病细 胞 系 Ｋ ６ ５２及其 多 药耐药细胞 系 Ｋ ６１０ ５２Ａ ２细胞 的凋亡诱 导作 用 ， 以探 讨 Ａ 是嘎 对多药耐药 白血病细胞 的作用
８ 流式细胞 术检测 Ｐ７ １０表达 取经 Ａ
作用后 的各 组
验前无药传代 ３改
３ 哪 作用 法测定 Ａ 对 Ｋ６ ５ ２及 Ｋ ６／０ 细胞 的生 长抑 制 ５ ２Ａ ２
Ｋ ６Ｊ ０ 细胞 ｌ ，０ｇＬ多聚甲醛溶 液固定 细胞 ， ５ ２Ａ ２ １ ／ 与小 鼠抗 Ｍ Ｋ１ Ｒ一 ６单抗和藻红蛋 白（ Ｅ 标记兔 抗 鼠二抗 ３ Ｐ） ７℃作用 ３ ０
维普资讯
２０ ０ ２年 １月第 ２ ３
ＶＪ３Ｎ ｏ２．ｏ
・
研 究 报 告 ・
三氧化二砷对 Ｋ ６ ５２及其 多药耐 药细胞 系 Ｋ６ｔ０ ５ ２Ａ ２细胞 的诱 导 凋 亡研 究
邹俊 晖 潘祥 林 冯 长伟 郭娟娟
公 司提供 ） 要求 操作。
１ 药 品
０【
公 司 干 Ｈ ｎｓ 冲液 中 ， ， ／ ２ 细 胞 株及 细胞 培 捧 Ｋ ６ ５ ２受 其 多药 耐药 细 胞 系 Ｋ ６ ／ ５２
（ Ｈ ７５ ， ｐ ）体积分数 为 ９ ％的甘油 ， ￣ ｌ ｙ ｒ ９０ ，７ － ， ０ ４ｎ ／ ｒ ］ ｏ ３ Ｌｌ ℃水浴 １ｈ 。在 ３Ｏ岫 激 发波 长和 ４０岫 发散波 长下 用荧 ６ ４
ｒｎｌ 焦磷 酸钠 ］０ ， 复用 嗳头 吹打并 振荡 ， ｍ ｏＬ ／ １０ 反 室温 作 用 ３ ｉ， 心 取 上 清 液 ， 后 加 人半 咣 无冬 酶 ３底 物 Ａ － ０ｍｔ 离 ｔ 而 Ｃ
三氧化二砷对淋巴瘤细胞作用机制的研究进展论文
三氧化二砷对淋巴瘤细胞作用机制的研究进展【中图分类号】r734.2 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）11-0660-01三氧化二砷作为传统中药砒霜的主要成分，体内外研究和临床实践均已发现其对造血系统及其它系统的多种恶性肿瘤有较好的疗效，其对不同肿瘤细胞的抑制增殖、凋亡机制、作用靶点等方面又不尽相同，本文主要阐述近年来三氧化二砷作用于淋巴瘤细胞方面的研究进展。
1 抑制淋巴瘤细胞增殖、诱导凋亡诱导肿瘤细胞凋亡被认为是三氧化二砷（as2o3）抗抗肿瘤的基本机制。
三氧化二砷通过对淋巴瘤细胞的诱导凋亡机制主要通过影响线粒体的跨膜电位、影响细胞内氧化状态、调节凋亡基因的表达、抑制端粒体活性、及端粒体逆转录酶基因的表达等方面起凋亡作用的。
1.1 通过线粒体途径诱导淋巴瘤细胞凋亡研究表明，巯基氧化或者交联是诱导细胞凋亡的重要因素。
其主要机制在诱导线粒体膜通透性转运孔（ptp）的开放，进而导致线粒体跨膜电位下降和细胞凋亡。
dai等[1]报道，细胞内gsh含量对as2o3诱导b淋巴瘤细胞株的凋亡起决定性作用，上调gsh浓度会减低其对as2o3的敏感度。
这可能是含巯基的gsh与细胞含巯基蛋白竞争与as2o3的结合所致。
zhu等[2] 报道，γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂（ buthionine sulfoximine， bso）可加强as2o3诱导恶性淋巴细胞的崩溃和凋亡，因为bso选择性地抑制γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性而导致细胞内gsh耗竭。
1.2 抑制淋巴瘤细胞增殖高岩等报道[3]：as2o3体外可抑制对鼠源性t细胞淋巴瘤el4细胞增殖并可以诱导细胞凋亡。
龙轶等[4]报道： 1- 8μm ol /l as2o3 能明显抑制raji细胞的活力，并存在一定的量效、时效关系。
2 - 8μm ol /l 浓度的as2o3可以诱导ra ji细胞周期阻滞及凋亡，而1umol /l as2o3不诱导细胞凋亡，只是通过细胞周期阻滞作用抑制细胞增殖。
三氧化二砷抑制cdc2基因表达诱导K562白血病细胞G2／M周期停滞
度 依 赖 性 下 调 ，ｄ２ｐ水 平 在 ２ ５／ ｌＬ时 无 明 显 变 化 ， １ ￣ ｌ 时 受 抑 明显 ，ｈ ｌ 白表 达 水 平 在 Ａ ｚ 作 用 ｃ ｃ一 ～ ￣ ／ ｍｏ 在 ０／ ／ ｍｏ Ｌ ｃｋ 蛋 ｓＯｓ 前 后 无 明显 改 变 。 结 论 Ａ 。 著 诱 导 Ｋ５ ２白血 病 细 胞 ＧｚＭ 周 期停 滞 ， 机 制 与 抑 制 ｃｃ ｓＯ 显 ６ ／ 其 ｄ２转 录 水 平 ， 调 活 性 化 下
摘要 目的
检 测三 氧化二砷（ｒｅ ｉ ｔｉｘ ｅＡｓ０ ） ａｓｎｃ ｒ ｉ ， 。 诱导慢 性髓 系 白血病急 变细胞 Ｋ５２周 期停滞 中细 胞周期 ｏｄ ６
体 外 培 养 Ｋ５ ２细 胞 ， 用 Ｐ 染 色 、 ６ 采 Ｉ 流式 细胞 仪 检 测 ＡｓＯｓ 用 后 细 胞 周 期 分 布 ｚ 作２
Ａｒｅ ｉ ｒｏ ｉｅＩ ｄ ｃｎ ／ ｒｓ ｆＫ５ ２Ｃ ｌ Ｌｉｅｖａ ｓｎｃＴ ｉｘｄ ｎ ｕ ｉｇＧ２ Ｍ Ａｒｅｔｏ ６ ｅｌ ｎ ｉ
Ｄｏ ｎ ｒ ｇ ｌ ｔｎ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｄ ２ Ｇｅ ｅ ｉ ｉｒ ｗ — ｅ ｕ ａ ｉ ｇ Ｅｘ ｅ ｓｏ ｆｃ ｃ ｎ ｎ ｖ ｔ ｏ Ｃｈ ｎ Ｚ ｉｈ ｏ ｅ ｈ ｃ ａ 。Ｌｉ ｕ ａ ，ＬｎＪａ ｔ ｌ Ｑｉ ｂ ｉ ｉｎ ｅ ａ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｏｂｅ ｔ ｅ Ｔｏｅｕ ｉａｅｔ ｅｐ ｓｉ ｌ ｍｏｅ ｕａ ｉｌｇｃｒ ｌ ｆ ｒｅ ｉ ｒｏ ｉｅ（ ２ ）ｉｄ ｃｎ ／ ａ ｒｓ ｆ ｓｒ ｃ ｊｃｉ ｖ ｌ ｃ ｔ ｈ ｏ ｓｂｅ ｌｃ ｌｒｂｏｏ ｉ ｏｅｏ ｓｎｃｔｉｘｄ Ａｓ０３ ｎ ｕ ｉｇ Ｇ２ Ｍ ｒｅ ｔｏ ｄ ａ
Ｉ ｓ ｔ ｔ ｏ ｍ ｔｌｇ Ｕ ｉｎ Ｈｏ ｐ ｔ ｌ ｏ ｇ Ｍｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ ｎｔ ｕ ｅ ｆ Ｈｅ ａ ｏｏ ｙ， ｎ ｏ ｓ ｉ ，Ｔ ｎ ｊ ｉ ａ ｉ ｄ ｃ ｌ ｇ ，Ｈｕ ｚ ｏ ｇ ａ Ｃ ｅ ａｈｎ Ｕ ｉｅｓｔ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ｎ ｅｈ ｏｏ ｙ， ｈ ｎ４ ０ ２ ｎ ｖ ｒｉ ｏ ｃｅ ｃ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ Ｗｕ ａ ３ ０ ２ ｙ ａ
三氧化二砷诱导K_(562)细胞凋亡的初步研究
三氧化二砷诱导K_(562)细胞凋亡的初步研究
张日;朱子玲;仇红霞;夏学鸣
【期刊名称】《苏州医学院学报》
【年(卷),期】1999(19)11
【摘要】目的：探讨三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗慢性粒细胞性白血病（ＣＭＬ）的机制。
方法：以ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２为模型，通过细胞增殖、活力检测、形态学观察、肿瘤集落形成的琼脂糖凝胶电泳等检验。
结果：经≥２．５μｍｏｌ
／ＬＡｓ２Ｏ３处理的Ｋ５６２细胞可出现增殖受抑和凋亡的形态学改变及ＤＮＡ片段化。
结论：Ａｓ２Ｏ３能有效地诱导Ｋ５６２细胞凋亡。
【总页数】3页(P1156-1158)
【关键词】三氧化二砷;K562细胞;细胞凋亡;白血病;CML
【作者】张日;朱子玲;仇红霞;夏学鸣
【作者单位】苏州医学院附属一院
【正文语种】中文
【中图分类】R733.720.5
【相关文献】
1.脐血CD_3AK细胞诱导K_(562)细胞凋亡的实验研究 [J], 何秉燕;张渝侯;邹典定;邓华秀;李小明;肖永芳
2.当归多糖诱导K_(562)白血病细胞凋亡及相关凋亡基因的实验研究 [J], 曾炜炜;
邹典定
3.三氧化二砷对K_(562)细胞凋亡的诱导及生长抑制作用的研究 [J], 王淑婷;李清;刘超;赵瑾瑶;于丽敏;卢步峰;杨佩满;于曦;董少元;乔永平;朱晓杰;管晓东
4.As_2O_3诱导K_(562)细胞凋亡过程中细胞表面电荷变化的研究 [J], 苏永宏;彭晓;焦宁超;王东海
5.氧化诱导K_(562)细胞凋亡机制的初步探讨 [J], 高颖;许彩民;杨洋;潘华珍
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Salirasib诱导K562细胞凋亡及其作用机制的研究的开题报告
Salirasib诱导K562细胞凋亡及其作用机制的研究
的开题报告
一、选题背景与意义：
Salirasib是一种新型的Ras特异性抑制剂，已被证明在多种人类癌
症中具有细胞凋亡的效应。
K562细胞是一种人类慢性髓性白血病细胞系，其抗肿瘤治疗研究受到广泛关注。
因此，本研究旨在探讨Salirasib对
K562细胞凋亡的诱导作用以及其作用机制。
二、研究内容：
本研究将采用体外细胞培养技术，通过MTT法测定不同浓度的Salirasib对K562细胞生长的影响，并利用荧光显微镜观察其对K562细
胞凋亡的影响。
同时，运用Western Blot法检测Salirasib对K562细胞
凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的影响，并通过实验验证其在Salirasib 诱导凋亡中的作用。
三、研究预期成果及其意义：
预计本研究的预期成果为探究Salirasib对K562细胞的凋亡诱导作
用及其作用机制。
此外，将为寻找新型抗癌药物提供新思路和药物研发
方向，同时为深入研究人类慢性髓性白血病的治疗以及肿瘤凋亡的精细
机制研究提供新的理论基础。
基于非靶向代谢组学研究三氧化二砷对白血病K562细胞的毒性机制
基于非靶向代谢组学研究三氧化二砷对白血病K562细胞的毒性机制任富玉;马强;刘治;李晓晶;苏燕【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2024(40)5【摘要】目的:研究三氧化二砷(As_(2)O_(3))对白血病K562细胞代谢的影响。
方法:利用CCK-8法检测As_(2)O_(3)对K562细胞活力的影响;采用超高效液相色谱-质谱技术对As_(2)O_(3)孵育后细胞中的代谢物进行鉴定,筛选出差异代谢物,并进行KEGG富集分析。
结果:CCK-8结果显示,As_(2)O_(3)可剂量依赖性地降低K562细胞存活率。
非靶向代谢组学检测结果表明,As_(2)O_(3)可导致K562细胞内多种代谢物含量发生显著变化。
KEGG富集分析表明,差异代谢物主要富集在谷胱甘肽代谢、铁死亡、亚油酸代谢、牛磺酸代谢、癌症中的胆碱代谢、嘌呤代谢等通路。
结论:As_(2)O_(3)可显著降低K562细胞存活率,这可能与影响细胞多种代谢稳态,进而导致细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡等有关。
此外,As_(2)O_(3)是否会诱导K562细胞发生铁死亡值得深入研究。
【总页数】6页(P6-11)【作者】任富玉;马强;刘治;李晓晶;苏燕【作者单位】内蒙古科技大学包头医学院生物化学与分子生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.通过非靶向代谢组学和稳定同位素示踪技术分析索拉非尼耐药白血病细胞的代谢重编程和氧化还原适应2.基于非靶向代谢组学与转录组学探究氨基酸缓解甘草酸苷致大鼠假性醛固酮增多症的分子机制3.基于非靶向代谢组学的APP/PS1小鼠与认知功能障碍相关的生物标志物发现及黄连解毒汤干预机制研究4.基于非靶向代谢组学的老年胃癌患者术前衰弱与代谢综合征代谢特征研究5.基于非靶向代谢组学比较手工和机制信阳毛尖的代谢物差异因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
三氧化二砷诱导K562细胞线粒体跨膜电位的变化及其机制研究
三氧化二砷诱导K562细胞线粒体跨膜电位的变化及其机制研究王颖超;曹励之;张朝霞;徐学聚;殷小成;盛光耀【期刊名称】《中华实用儿科临床杂志》【年(卷),期】2005(020)001【摘要】目的了解三氧化二砷(As2O3)诱导慢粒细胞系K562细胞株凋亡是否与线粒体跨膜电位(△ψm)改变有关及其可能机制.方法联合应用As2O3和巯基还原剂--二巯基苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)耗竭剂--丁硫堇(BSO)处理K562细胞株,通过测定细胞内荧光染料碘化丙啶(PI)/Rhodamine123(Rh123)的色强度分析线粒体跨膜电位(△ψm),通过测定细胞活力、亚G1期细胞含量及形态学观察等鉴定细胞凋亡.结果 As2O3砷可明显诱导K562细胞线粒体△ψm下降.BSO可加强As2O3砷诱导的K562细胞凋亡和线粒体△ψm下降,而DTT则有部分拮抗作用.在2×10 6mol/L As2O3处理72 h的K562细胞,细胞膜完整但线粒体△ψm下降的凋亡细胞(PI-Rh123)达(26.0±2.5)%,当1×10-3mol/LBSO同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数上升达(37 2± 5.7)%和(39.1±4.5)%;而当2×10-4mol/L DTT同时处理时,PT-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(11.5±1.3)%和(15.4±3.5)%.结论线粒体跨膜电位下降是As2O3砷诱导K562细胞凋亡的关键环节,其机制可能与巯基氧化有关,巯基可能是As2O3诱导细胞凋亡的重要分子靶子.【总页数】2页(P18-19)【作者】王颖超;曹励之;张朝霞;徐学聚;殷小成;盛光耀【作者单位】郑州大学第一附属医院,儿科,郑州,450052;中南大学湘雅医院,儿科,长沙,410008;中南大学湘雅医院,儿科,长沙,410008;郑州大学第一附属医院,儿科,郑州,450052;中南大学湘雅医院,儿科,长沙,410008;郑州大学第一附属医院,儿科,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R725.5【相关文献】1.TGFβ1在三氧化二砷诱导K562细胞分化中的作用与分子机制研究 [J], 张永田;王焱;董琳;毕可红2.乙醇诱导肝细胞线粒体质量和跨膜电位变化的研究 [J], 朱萍;阎明;张莉;王旭平;商楠;刘慧敏;张海涛3.三氧化二砷诱导慢性粒细胞系K562细胞凋亡及细胞周期变化研究 [J], 王颖超;曹励之;殷小成;俞燕;张朝霞;张国元4.电脉冲诱导的肝癌细胞凋亡效应和线粒体跨膜电位变化 [J], 姜方弋;唐丽灵;刘欢;曾超;米彦;梁可道;孙才新5.三氧化二砷诱导K562/ADM细胞凋亡的作用机制研究 [J], 王东海;魏虎来;苏永宏;郝春燕;刘建民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株作用的初步研究的开题报告
三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株作用的
初步研究的开题报告
题目：三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株作用的初步研究
一、选题背景
当今医学界对白血病的治疗研究已有较多的进展，但是在临床上依然存在许多挑战。
三氧化二砷（ATO）、柔红霉素（ADM）是目前治疗白血病较为常用的药物之一，但是它们各自存在单一的抗肿瘤作用，存在药物抵抗以及副作用等问题。
因此，探索不同药物联合应用在治疗白血病中的协同作用，对于提高药物疗效、降低药物副作用意义重大。
二、研究目的
本研究旨在探究三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株的作用机制，为临床应用提供理论依据。
三、研究内容
1. 建立K562A02细胞株模型。
2. 构建实验方案，探究三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株的作用。
3. 通过免疫荧光实验和Western blot检测药物的作用机制。
四、研究意义
1. 探究三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株的作用机制，为临床治疗提供目标。
2. 建立K562A02细胞株模型，为白血病的研究提供指导。
3. 为药物联合应用提供实验支持，促进临床疾病治疗的发展。
五、研究方法
1. 抗肿瘤药物的制备。
2. 细胞培养技术。
3. Western blot检测与免疫荧光实验。
4. 统计学分析。
六、研究预期成果
探究三氧化二砷协同柔红霉素对K562A02细胞株的作用机制，为临床治疗提供目标，建立K562A02细胞株模型，为药物联合应用提供实验支持，促进临床疾病治疗的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
文章编号(Article ID):1009-2137(2004)05-0558-05・论著・三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的机制探讨张旭辉,张日,朱子玲,王玮苏州大学附属第一医院血液科,江苏省血液研究所,苏州215006摘要 本研究旨在探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,A TO)诱导P210Bcr2Abl K562细胞凋亡的发生机制。
采用细胞培养、细胞形态观察、流式细胞术(FCM)测定凋亡细胞和细胞周期,应用半定量逆转录2聚合酶链反应(RT2PCR)分析A TO作用不同时间后K562细胞bcl2XL和bcr2abl基因的改变,并检测胞浆细胞色素C(cyt C)、半胱天冬酶3 (caspase23)蛋白的表达。
结果表明:2.5μmolΠL A TO作用48小时可诱导K562细胞凋亡,凋亡进程中细胞胞浆内cyt C蛋白浓度增高,caspase23活性增强;RT2PCR显示A TO对bcr2abl基因表达无明显影响,但12小时可下调bcl2 X L基因。
结论:A TO通过激活胞浆线粒体下游的cyt C和caspase23激酶活性而诱导K562细胞凋亡,bcl2X L基因下调也促进了细胞凋亡。
关键词 三氧化二砷;K562细胞;细胞凋亡中图分类号 R97911;R73317文献标识码 AThe Mechanism of Arsenic T rioxide2Inducing Apoptosis of K562CellsZHA N G X u2Hui,ZHA N G Ri,ZHU Zi2L i ng,W A N G WeiJiangsu Instit ute of Hematology,The Fi rst A f f iliated Hospital of S uz hou U niversity,S uz hou,215006Chi naAbstract The aim was to investigate the mechanism of arsenic trioxide(A TO)inducing apoptosis of K562cells that express P210Bcr2Abl.Apoptosis was analyzed by cell proliferation assay,morphological changes,DNA2PI staining and cell cycle analysis.EL ISA kits were also used to analyze the concentration of cytosolic cytochrome C and activation of cas pase23.Transcriptional levels of Bcl2X L and Bcr2Abl were assayed by semiquantitative reverse transcription ploymerase chainreaction(RT2PCR).The results showed that K562cells were induced to a poptosis after exposure to2.5μmolΠL A TO for at least48hours,and the cell cycle of K562cells was arrested at the G2ΠM phase.Caspase23was activated and there wasa cytosolic accumulation of cytochrome C.A TO could only reduce the transcriptional level of Bcl2X L,but could not down2regulate the Bcr2Abl transcriptional level.In conclusion,A TO can induce K562cells to a poptosis.The signal pathway mediated by the cytosolic translocation of mitochondria cytochrome C is one of the mechanisms for A TO inducin g apoptosis.And the decrease of Bcl2X L may induce more apoptosis.K ey w ords arsenic trioxide;K562cell;apoptosisJ Ex p Hem atol2004;12(5):558-562慢性粒细胞白血病(CML)是一种源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,其特征性bcr2abl融合基因和P210Bcr2Abl融合蛋白是CML发病和疾病进展的主要原因1。
近年来,三氧化二砷(arsenic trioxide, A TO)已被成功地应用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL),其疗效机制与凋亡相关。
1999年,本实验室曾报道A TO还可诱导CML细胞株K562细胞凋亡2,本研究对其具体机制进行了较深入阐明,现将结果报道如下。
材料和方法试剂A TO(购自Sigma公司)溶于灭菌NaOH,配制成10 mmolΠL溶液,室温保存。
半胱天冬酶3(caspase23)特异性抑制剂Z2DEVD2fmk(购自R&D System)溶于75μl DMSO,配制成20mmolΠL溶液,-20℃保存,工作液浓度为50μmolΠL。
TRI ZOL购自G ibco BRL公司,bcl2X L、β2微球蛋白、PCR引物的合成纯化及PCR试剂(TaqDNA聚合酶及缓冲液、dN TPs)均由上海生工公司提供。
蛋白酶K、RNA酶及琼脂糖购自美国Promega公司,碘化丙锭(PI)购自美国Coulter2Immunotech公司。
细胞培养表达P210BCR2ABL的K562细胞为本所保存,按常规生长于含10%FCS的RPM I1640培养基中,置于基金项目:本课题为江苏省卫生厅重大项目资助(编号H200206)通讯作者:张日.电话:(0512)652236372003-11-26收稿;2004-06-16接受・855・中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2004;12(5):558-56237℃、5%的CO2培养箱中培养。
细胞生长曲线测定将对数生长期K562细胞以1×105Πml浓度接种于24孔板,每孔加入2.5μmolΠL A TO或添加50μmolΠL Z2DEVD2fmk于培养体系中,每一浓度设3个平行孔,在细胞处理后不同时间收集细胞,用台盼蓝拒染法计算活细胞数,绘出细胞增殖曲线。
细胞形态学观察取对数生长期细胞,加A TO作用24小时后收集细胞,通过离心涂片机(27197×g离心5分钟)甩片,瑞氏染色后,光镜下观察细胞形态。
流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡率和细胞周期将待测细胞固定于70%的乙醇中,4℃过夜,经磷酸钠2柠檬酸缓冲液(p H7.8)低渗处理,RNase A消化,PI染色,FCM检测。
胞浆细胞色素C(cyt C)浓度测定按cyt C浓度检测试剂盒(Bender MedSystems产品)说明书要求进行,样品及标准品均采用复孔。
caspase23活性测定按caspase23活性检测试剂盒(R&D System产品)说明书要求进行,样品及标准品均采用复孔。
caspase23阻断实验取对数生长期细胞,加入相应浓度A TO和caspase23特异性抑制剂Z2DEVD2fmk,共同培养不同时间后计数细胞,观察细胞形态并测定caspase23活性。
RT2PCR半定量测定bcr2abl融合基因mRNA表达2.5μmolΠL A TO加入K562细胞培养体系中,在培养24、48、72、96小时分别收集细胞,TRI ZOL一步法提取总RNA,紫外分光光度仪定量;RNA逆转录合成cDNA,逆转录体系40μl,其中总RNA2μg,其余按常规,75℃变性5分钟,37℃反应45分钟,95℃5分钟,然后PCR扩增,引物设计参照文献进行,bcr2 abl引物(230bp)正义链:5′2G AA GTGTTTG A G2 AA GCTTCTC23’,反义链:5′2TG A TTA TA GCCT2 AA GG ACCCG23′;β22M G引物(330bp)正义链:5′2 CTCGCGCTACTCTCTCTTTC23′,反义链:5′2CA2 TGTCTCG A TCCCACTTAAC23′,PCR扩增按常规方法,反应体系50μl,其中逆转录产物3μl,94℃预变性5分钟后,94℃变性30秒,62℃退火30秒, 72℃延伸1分钟,共27个循环,最终72℃延伸7分钟;取PCR产物10μl,在1.5%琼脂糖凝胶电泳(80 V,30分钟),V ILB ER LOU RMA T凝胶成像仪观察并拍照。
RT2PCR半定量测定bcl2X L表达水平2.5μmolΠL A TO加入K562细胞共培养,在培养12、24、48、72、96小时分别收集细胞,TRI ZOL一步法提取总RNA,紫外分光光仪定量;RNA逆转录合成cDNA,逆转录体系40μl,其中总RNA2μg,其余按常规,75℃变性5分钟,37℃反应45分钟,95℃5分钟,然后PCR扩增,引物设计参照文献,bcl2XL引物(110bp)正义链:5′2CCGGG A TGGGGTAAA2 CTGGGG23′,反义链:5′2CCA GCCGCCGTTCTCC2 TGG A T23′;β22M G引物(330bp)正义链:5′2C2 TCGCGCTACTCTCTCTTTC23′,反义链:5′2CA T2 GTCTCG A TCCCACTTAAC23′,PCR扩增按常规方法,反应体系50μl,其中逆转录产物4μl,94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸1分钟,共28个循环,72℃延伸7分钟;取PCR 产物10μl,在1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V,30分钟),V ILB ER LOU RMA T凝胶成像仪观察并拍照。
统计学处理采用 x±s表示,应用SPSS10.0软件分析相关数据。
结 果AT O抑制K562细胞的生长K562细胞经2.5μmolΠL A TO作用48小时后,活细胞计数表明A TO对K562细胞的增殖抑制率达50%左右(P<0.05);而同时加入caspase23特异性抑制剂Z2DEVD2fmk共同培养的细胞与对照组细胞生长趋势无明显差异(P>0.05)(图1)。