第十八章氨基酸已

提取：发酵液用盐酸调到pH4.0～4.5，初结晶， 2 h后调pH3.0～3.2，降温结晶，虹吸去上层， 下层经离心处理的粗谷氨酸，收率可达到80%。 精制：粗谷氨酸溶于适量水，用活性炭脱色， 加入碳酸钠，中和成盐，再进一步精制得到谷 氨酸成品。
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谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵 解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成 丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然 后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊 二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条 件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生 长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发 酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下， 才能得到高产量的谷氨酸。
制法 抽提法 抽提法 合成法 合成法 发酵法 发酵法 发酵法 发酵法 发酵法 抽提法 发酵法 发酵法
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第一节 氨基酸的生产
二、氨基酸产生菌的选育 氨基酸是细胞组分，受到严格的代谢调
节控制。 想让菌种积累大量的某一个氨基酸，必
须打破微生物对该氨基酸的代谢调控。 如选育营养缺陷型或氨基酸类似物抗性 突变，可以减弱或消除氨基酸终产物阻 遏。
第十八章氨基酸已
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概述
氨基酸是构成蛋白成分。 第一个用发酵法生产的氨基酸是谷氨酸。
目前世界上可用发酵法生产的氨基酸有 20多种。
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氨基酸的用途
1.食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜
味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯)，此产品1981 年获FDA批准，现在每年产量已达数万吨。 2.饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料。
菌株解除反馈调节
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影印法 影印接种
完全培养基 营养缺陷型
基本培养基
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菌丝 过滤法
筛选营养突变株
菌丝过滤得 营养突变株
长出菌丝体 （野生型）
基本培养基
接入微生物孢子
（含营养突变株）
涂布均匀后培养
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限量补充培养法
微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株
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夹层培养法及结果
小菌落是第二次长起 来的（营养缺陷型）
据专家估计，到2010年，世界氨基酸产值可达50 亿美元，占生物技术市场的8%，国内的氨基酸 产值可达40亿元，占全国发酵产业总产值的12%。
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第一节 氨基酸的生产
一、氨基酸的生产方法
（一）提取法：生产氨基酸最早采用的生产 方法。将蛋白质原料酸水解，然后从水解 液中抽提出氨基酸。
（二）直接发酵法：利用微生物的作用直接将
粮食原料经过发酵生产氨基酸。野生菌株发酵、营
养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、 抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营 养缺陷型回复突变株发酵。
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（三）添加前体法：利用微生物转化相应的氨基 酸的前体，成为相应的氨基酸。如：利用嗜甘 油棒杆菌将甘氨酸转化为丝氨酸。
（四）酶法：利用微生物产生的酶来制造氨基酸。 如赖氨酸、色氨酸等可用此法。
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二、氨基酸产生菌的选育
（一）氨基酸产生菌的分离 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清
楚，代谢途径比较简单 1.产生菌的来源：采样分离；一般为细菌
（棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌）；分离时要抑制真 菌（50μg/mL匹马菌素） 2.分离方法：平板分离
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二、氨基酸产生菌的选育
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黄色短杆菌合成赖氨酸的途径
天冬氨酸
抑制 天冬氨酸激酶
中间产物Ⅰ
？
中间产物Ⅱ
高丝氨酸 脱氢酶
高丝氨酸
高丝氨酸缺陷型
菌株不能合成高丝氨 酸酶，故不能合成高 丝氨酸，也不能合成 苏氨酸和甲硫氨酸。 在补给适量的高丝氨 酸的条件下,就可产生 大量的赖氨酸。
甲硫氨酸 苏氨酸
过量
赖氨酸
？
改变微生物的遗传特性 ---应用营养缺陷型
精氨酸
D-精氨酸
苯丙氨酸
对氟苯丙氨酸
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二、氨基酸产生菌的选育
（四）细胞透性改变突变株的选育
1.目的：使胞内的代谢产物迅速渗漏出去，解除末 端产物的反馈抑制。
2.方法: ①透性酶（诱发突变） ②生理学手段——直接抑制膜的合成或使膜受缺
损（生物素缺陷型） ③膜缺损突变株 ——油酸缺陷型、甘油缺陷型 ④添加适量的青霉素
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天冬氨酸
天冬氨酸激酶 ①
天冬氨酰磷酸
高丝氨酸脱 天冬氨酸-β-半醛 ②
氢酶hom
③
高丝氨酸
④
二氢吡啶-2，6二羧酸
高丝氨酸 磷酸
O-琥珀酸高 丝氨酸
赖氨酸
苏氨酸
⑤
异亮氨酸
优先合成
蛋氨酸
反馈抑制
阻遏
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第二节 赖氨酸发酵
一、赖氨酸的生物合成途径 微生物的赖氨酸生物合成存在两条不同的途径，即二
培养： 菌落周围指示菌生长
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C.液体培养基中氨基酸产生菌的检测 a.过滤除菌发酵液（含该菌产生的AA）+ 氨基酸
测定培养基（含氨基酸鉴定菌——该AA缺陷 ） →37℃，16-23h，测定细胞密度或浊度。 b.发酵培养基（不接种产生菌）+ 已知浓度的特 定氨基酸样品+鉴定菌→37℃，16-23h，测定 细胞密度或浊度。
制法 发酵法、合成法 抽提法、发酵法 发酵法 发酵法 合成法 合成法、酶法 合成法 合成法、发酵法 发酵法、酶法 发酵法、抽提法 发酵法、抽提法 发酵法 酶法
名称 L-半胱氨酸 L-酪氨酸 甘氨酸 DL-丙氨酸 L-丙氨酸 L-丝氨酸 L-谷氨酸胺 L-谷氨酸 L-脯氨酸 L-羟基脯氨酸 L-鸟氨酸 L-瓜氨酸
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谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径
葡萄糖
中间代谢产物
α —酮戊二酸
切断
谷氨酸脱氢酶 抑制
N+ H4
减少 谷氨酸 过多
原因：生物素是脂肪酸生 物合成中酶的辅基，此酶 可催化物质反应，最终与 合成细胞膜磷脂的主要成 分—脂肪酸有关。
改变细胞膜的透性 ---把生物素的浓度控制在
亚适量的情况下，才能分
泌大量的谷氨酸。
（五）合成法：用化学合成的方法制造氨基酸。 DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。
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氨基酸生产方法的比较
合成法 发酵法
原料
石油 碳源和氮源
产物浓度
高
低
产物类型 DL-型
L-型
副产物
少
多
酶法 底物和酶
高 L-型
少
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名称 L-缬氨酸 L-亮氨酸 L-异亮氨酸 L-苏氨酸 DL-蛋氨酸 L-蛋氨酸 L-苯丙氨酸 L-色氨酸 L-赖氨酸 L-精氨酸 L-组氨酸 L-天门冬氨酰 L-天门冬氨酸
pH 磷酸
N-乙酰谷酰酸←→谷氨酸 （酸性） （中性或微碱性7-8 ）
缬氨酸←→谷氨酸 （高浓度磷酸）
生物素
乳酸或琥珀酸←→谷氨酸
（饱和）
（限量--亚适量） 27
谷氨酸发酵罐的培养基装量比为0.7，接种量为 0.5%～1%，前期温度为33～35 ℃， 后期为 36～38 ℃，通气1∶0.11～0.13(V/V)，发酵12 h后开始流加尿素。维持发酵液pH在7.0以上， pH下降后再次流加尿素，需要流加3～5次。
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二、赖氨酸发酵的研究 1.防止回复突变（第一节已述及） 2.发酵控制（菌种、工艺不同而异） 碳源：糖蜜、葡萄糖、蔗糖等。 氮源：硫酸铵、尿素、氨水、玉米浆、麸皮水解液、豆
饼水解液等。
发酵前期：菌体生长期，很少产酸（0-20h） 。 产酸期：至放罐 工艺控制：温度32℃ 、补氨控制pH6.5-7.5、种龄和种
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二、氨基酸产生菌的选育
（二）氨基酸营养缺陷型突变株的选育方 案
1.配制以下培养基 2.诱变与营养缺陷型突变株的分离 3.营养要求的测定
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1.配制以下培养基 ①基本培养基(MM)：能满足野生型菌株正常
生长的培养基； ②完全培养基(CM)：能满足各种营养缺陷型生
长的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽 汁培养基等； ③补充培养基(SM)：在基本培养基中加入相应 的营养成分，以满足相应营养缺陷型菌株生 长的合成培养基。
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三、氨基酸发酵的代谢控制 （一）发酵条件控制 （二）生产菌株的稳定
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（一）发酵条件控制 33～35 ℃；34-37℃
表 谷氨酸产生菌因培养条件的代谢变化
控制因子
发酵转换
氧
乳酸或琥珀酸←→谷氨酸
（通气量不足） （通气量充足）
NH4+
α-酮戊二酸←→谷氨酸←→谷酰胺 （减少） （适量） （过量）
氨基庚二酸途径与α-氨基已二酸途径。前者存在于细 菌、绿藻和高等植物之中，后者存在于酵母霉菌之中。 生产上用谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌等 细菌。 理想的产生菌应为hom–+AECr+AHVr
高丝氨酸脱氢酶（hom） S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸(AEC)——赖氨酸结构类似物 -氨基--羟基戊酸(AHV)——苏氨酸结构类似物
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2.诱变与营养缺陷型突变株的分离 诱变：物理诱变、化学诱变
↓ 淘汰野生型：抗生素（青霉素）法
↓ 检出缺陷型：影印法、点种法、夹层法等 检出原理：利用固体培养基，缺陷型在CM上生长良好，
在MM上则不生长，而野生型都能生长。
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3.营养要求的测定 利用补充培养基(SM)（在基本培养基中
加入相应的氨基酸成分）。
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二、氨基酸产生菌的选育
（三）氨基酸结构类似物抗性突变株的选 育
1.目的：解除氨基酸的反馈抑制和阻遏 2.突变株形成原因：参看课本P356 3.氨基酸结构类似物