高效液相色谱法
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高效液相色谱法
21
3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。 可用作正相色谱得固定相,洗脱剂常用
非极性或弱极性溶剂,加入适量得极 性溶剂,以调节洗脱强度。 极性小得先出峰,极性大得后出峰。
22
正相色谱常用固定相结构
氰 基
-(CH2)3C=N
氨 基
-(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇
-(CH2)3OCH(OH)CH2OH
等。
33
反相色谱得特点
A 适于分离带有不同疏水基团得化合物。 B 可通过改变溶剂组成与pH,来分离不同极
性得化合物。 C 可分离从极性到非极性得宽范围得化合物。
34
正相色谱得应用
正相色谱适用于分离极性化合物。如:酚 类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟 基化合物、氨基酸与药物等。这些样品在 正己烷或其它烷烃溶剂中得溶解度很小, 在极性溶剂中得溶解度良好。用正相色谱 分离可得到较好得效果。
2)装柱要求 均匀紧密、不破坏颗粒、不形 成裂缝 、颗粒粗细不可分级
53
3、色谱柱柱效得评价
最小理论塔板数 n＞104 分离度R≥1、5 拖尾因子 f =0、95-1、05 相对保留值得再现性
54
4、 色谱柱得保 养
注意流动相得纯化 防止堵塞与污染 柱得操作压力＜装填柱得压力 应该用进样阀进样 防止柱得反冲 贮存色谱柱时应防止干涸 使用保护(预)柱
11
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
(1)无定形全多孔硅胶 : YWG ( 2)球形全多孔硅胶:YQG (3)堆积硅珠:YQG
高分子多孔微球:YSG
13
化学键合相色谱固定相
将固定液得官能团键合在载体得表面 而构成化学键合相。
3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。 可用作正相色谱得固定相,洗脱剂常用
非极性或弱极性溶剂,加入适量得极 性溶剂,以调节洗脱强度。 极性小得先出峰,极性大得后出峰。
22
正相色谱常用固定相结构
氰 基
-(CH2)3C=N
氨 基
-(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇
-(CH2)3OCH(OH)CH2OH
等。
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反相色谱得特点
A 适于分离带有不同疏水基团得化合物。 B 可通过改变溶剂组成与pH,来分离不同极
性得化合物。 C 可分离从极性到非极性得宽范围得化合物。
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正相色谱得应用
正相色谱适用于分离极性化合物。如:酚 类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟 基化合物、氨基酸与药物等。这些样品在 正己烷或其它烷烃溶剂中得溶解度很小, 在极性溶剂中得溶解度良好。用正相色谱 分离可得到较好得效果。
2)装柱要求 均匀紧密、不破坏颗粒、不形 成裂缝 、颗粒粗细不可分级
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3、色谱柱柱效得评价
最小理论塔板数 n＞104 分离度R≥1、5 拖尾因子 f =0、95-1、05 相对保留值得再现性
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4、 色谱柱得保 养
注意流动相得纯化 防止堵塞与污染 柱得操作压力＜装填柱得压力 应该用进样阀进样 防止柱得反冲 贮存色谱柱时应防止干涸 使用保护(预)柱
11
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
(1)无定形全多孔硅胶 : YWG ( 2)球形全多孔硅胶:YQG (3)堆积硅珠:YQG
高分子多孔微球:YSG
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化学键合相色谱固定相
将固定液得官能团键合在载体得表面 而构成化学键合相。
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
高效液相色谱法 HPLC
点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)
• 在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非 极性的配基（烷基、苯基等）上的保留， 就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基 结合而造成的。
• 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越 牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增 加，其保留值也增大。
（2）计量置换模型
• 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当 样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之 间结合面上的溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被 “挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样 品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶 剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个，与保留时被“挤” 走的溶剂分子相等。
2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、 分子量大、高极性的有机物（70~80%的有机 物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500~800μL），易制备。 (4)分离效率降低。
二、一般分离流程
高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，
§7-1 一般流程及分离原理
一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑， 新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力 和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min） →分离速度↑（7~8个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。
• 另外，对照（a）和（d）可以 发现刚上样后，溶质分子形成的 色带（又叫谱带）较窄，而到了 （d）中，各组分的谱带明显变 宽，这说明同一组分沿柱子移动 时，存在着扩散问题，即谱带的 扩散。
图7-2 三组分样品 分离过程示意图
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。
高效液相色谱法(HPLC)
4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相 反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中， 使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保 留行为的一种色谱法。
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5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检 测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换 色谱法不同的是分离组分的检测器不同）
1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相 溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是 在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高 了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
19
2、固定相 (1)担体(表面多孔型) 它是30～ 40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为 1 ～ 2μm的多孔硅胶。由 于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装 填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。
高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
1
2
3
4
§3- 1 高效液相色谱法概述
一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做 流动相的新色谱技术.
而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性 增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大 分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。
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②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色 谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱ห้องสมุดไป่ตู้离条件的选择。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
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子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实
质是样品分子与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子 间的作用。作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液
分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱 等类型。
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分；
按极性可分为极性、弱极性、非极性；
按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂:
己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
§3-1 高效液相色谱法的特点
HPLC： 是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型
分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极
为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱 基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、 高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、 灵敏度高、操作自动化的特点。
形成不同颜色的色带，他把玻璃管叫作”色谱 柱”，碳酸钙叫作“固定相”纯净的石油醚叫
作“流动相”。由此得名为“色谱“。该法后
来虽广泛用于无色物质的分离，但“色谱“一 词却被沿袭使用。
液相色谱分离原理及分类
液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相推动进入色谱柱。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离
高效液相色谱法的实际应用
※
利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中
的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质；反相
色谱分离水溶液中的物质（生化物质）。
※
用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法 分析离子型体的含量（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离 子等）。
※
流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - 影响容量因子k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间
出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分
子化合物。 利用手性固定相可以分离具有手性的化合物。
※
§3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
基础
热力学理论：塔板理论——平衡理论
理论
动力学理论：速率理论——Vander方程
液相色谱能完成难度较高的分离
气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，
与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而
在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高 选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以
上的液体作流动相，增大分离的选择性。
为减少传质阻力的影响， HPLC 对固定相均匀性和粒度的要 求更高。广泛使用薄壳型固定相和化学键合相固定相。 液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱 分离条件的选择。
在HPLC中, 速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可 以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u
故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。
影响分离的主要因素有流动大于0.5 cm/s时, H～u 曲线是一段斜率不大的直线。降
同的H-u曲线。
HPLC与GC的差别
1．分析对象的区别
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；
但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物
的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的
20%。
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质
溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量
操作严格，这是它的主要缺点。 在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
高效液相色谱法的特点
高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色 谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施 加高压。
高速：分析速度比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力
液固吸附色谱法（吸附色谱）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等， 较常使用是 5 ～ 10μm 的硅胶吸附剂。流动相为各种不同极性 一元或多元溶剂。 分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离 (利用溶质分 子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 。)
大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型 样品均可检测用途广泛，占有机物的80%。
2．流动相差别的区别 GC ：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合 作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合
作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分
§3-3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
• 液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography)
• 液液分配色谱法（LLC）
（liquid-liquid partition chromatography ） • 离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography） • 空间排阻色谱法（SEC） （steric exclusion chromatography）
研制高效柱填料是一活跃领域。
3. 流动相及流动相的极性
• 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。可显著改变组
分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。
• 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固
定相的极性，称为正相液液色谱，极性柱也称正相柱。
• 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱， 非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺 序相反。
离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，
改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，
当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动 相也可以增大分离选择性。
3．操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4．其他
液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。
高效液相色谱法吸取了气相色谱与经典液相色谱优点， 并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前 高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上 有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、 多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离 和分析。
HPLC尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵，
加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备， 流速最高可达 103cm· min-1。HPLC所需的分析时间较之经典液 相色谱法少得多，一般少于 1h 。 高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一 步提高了分析的灵敏度。
低流速，柱效提高不是很大。但
在实际操作中，流量仍是一个调 整分离度和出峰时间的重要可选 择参数。
2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其
选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度；
HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均 匀的球形固定相（dp≤10μm）；首选化学键合相， 匀浆法装柱；
2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流
动相——甲醇，约1ml/min；
3. 柱温的选择：选室温25℃左右。
第三章 高效液相色谱法
（High Pertormance Liquid Chromatography）
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树
脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。
戴安UltiMate3000
t R t0 (1 K
S ) Vm
S kK Vm
分离前提：分配系数K不等或容量因子k不等。
固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
硅胶 原理：吸附
特点：峰易拖尾
适用：分离极性化合物 高分子多孔小球 原理：吸附+分配，兼小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
吸附的水→固定液
液液分配色谱法（分配色谱法）
流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶，有一个明 显的分界面。溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：
高效液相色谱与气相色谱
液相色谱所用基本概念与气相色谱一致：保留值、塔板
数、塔板高度、分离度、选择性等。 液相色谱所用基本理论也与气相色谱基本一致：塔板理 论与速率方程。 液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相， 而液体和气体的性质不相同，由于液体的扩散性比气体 的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，流动相 传质阻力就显得特别重要，而纵向扩散项对色谱峰的扩 展基本上可忽略；而在气相色谱中，流动相传质阻力可 以忽略不计，而纵向扩散项的影响很明显。从而形成不