微波协同黑曲霉水解稻谷壳糖化工艺的优化

微波协同黑曲霉水解稻谷壳糖化工艺的优化作者：李湘苏来源：《湖北农业科学》2011年第07期摘要：以稻谷壳为原料，采用微波预处理协同黑曲霉水解稻谷壳制备还原糖。

探讨了经过微波预处理后原料的粒度、酶液用量、水解温度和水解时间对还原糖得率的影响，并采用响应面法建立二次回归模型对水解工艺进行了优化，在水解温度为６１℃、水解时间为１８．８ｈ、酶液用量为３１Ｕ／ｇ时，还原糖的平均得率可达到４６．１７％，比在相同工艺条件下未经微波处理的得率提高了９６．２２％。

关键词：还原糖得率；稻谷壳；黑曲霉；微波预处理；响应面分析中图分类号：ＴＳ２０１．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）07－1458-04Optimization of Microwave Assisted Aspergillus niger Hydrolysis Saccharification Technics of Rice HuskＬＩＸｉａｎｇ－ｓｕ（ＨｅａｌｔｈＳｃｈｏｏｌｏｆＮｕｃｌｅａｒＩｎｄｕｓｔｒｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ４２１００２，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｗａｓｍａｄｅｆｒｏｍｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｒｉｃｅｈｕｌｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓａｍｐｌｅｓｉｚｅ，ｖｏｌｕｍｅｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｙｉｅｌｄｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅａｎｄｖｏｌｕｍｅｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｕｎｄｅｒａｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ６１°Ｃａｎｄｖｏｌｕｍｅｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ３１Ｕ／ｇ，ｒｅａｃｔｆｏｒ１８．８ｈ，ｔｈｅｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｃｏｕｌｄｒｅａｃｈ４６．１７％．Ｔｈｅｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｙｉｅｌｄｈａｄｂｅｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ９６．２２％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｐｌｅｗｈｉｃｈｈａｄｎ＇ｔｂｅｅｎｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｍｉｃｒｏｗａｖｅａｔｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｓｙｉｅｌｄ；ｒｉｃｅｈｕｌｌ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ；ｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ还原糖因具有良好的生物相容性而广泛应用于医疗、食品、化工等众多领域。

稻谷壳是丰富而廉价的农业废弃物，大部分以焚烧的形式被处理掉，这不仅浪费了大量的资源还污染了环境。

稻谷壳中含大量的纤维素、半纤维素和木质素，经降解后可得到还原糖而应用于多个领域［１］。

采用生物质降解制备还原糖方面，目前主要集中在酸水解和酶水解两种途径［２］。

酶水解条件温和、能耗低、无污染；酸水解污染严重、副产物多，对设备腐蚀性大。

其中酶解作用能够导致结晶纤维素（Ｃｘ）被内切－β－葡聚糖酶作用生成无定形纤维素和可溶性低聚糖，然后被外切－β－葡聚糖酶作用直接生成葡萄糖（Ｃ１），也可被β－葡萄苷酶水解生成纤维二糖（Ｃｓ），再被水解得到葡萄糖［３，４］。

微波技术是２０世纪８０年代后期兴起的一种有机合成技术，微波预处理能改变植物纤维原料的超分子结构，使纤维结晶区尺寸发生变化，提高其反应活性［５］，从而提高酶解得率。

近年来，生物质降解和微波技术由于符合“绿色、环保”的要求而发展迅速。

但目前还没有关于利用微波预处理协同黑曲霉水解稻谷壳制备还原糖的报道。

本研究采用微波预处理协同黑曲霉对稻谷壳进行降解制备还原糖，对微波处理后原料的粒度、酶液用量、水解温度和水解时间等因素对还原糖得率的影响进行了探讨，并采用响应面法（ＲＳＭ）建立回归方程，对制备工艺进行了优化。

１材料与方法１．１材料稻谷壳，采自湖南农村，锯解风干后粉碎，过筛备用；黑曲霉，购于诺维信（中国）生物技术有限公司。

试验设备主要有：三口烧瓶；ＳＨＺ－８２数显水浴恒温振荡器（金坛市科兴仪器厂）；ＭＡＳ－Ⅱ型常压微波合成／萃取反应工作站（上海新仪微波化学科技有限公司）。

１．２方法１．２．１微波预处理在带回流装置的三口烧瓶中加入１０．０ｇ稻谷壳，用去离子水调节至液固比为２０∶１（ｍ∶ｍ），置于ＭＡＳ－Ⅱ型常压微波合成／萃取反应工作站中。

根据刘龙飞等［６］的研究结果，将微波功率选为５６０Ｗ，升温至沸腾并保温，微波处理４０ｍｉｎ。

将经过微波处理后的试样冷却至室温。

１．２．２还原糖的制备在经过微波处理后的试样中加入一定量的酶液和０．２ｍｏｌ／Ｌ的乙酸－乙酸钠缓冲液（ｐＨ值为４．８），置于ＳＨＺ－８２数显水浴恒温振荡器，将温度升到指定温度进行降解反应，保温一段时间，冷却出料，离心，离心液经适当稀释后进行还原糖测定。

将未经过微波处理的稻谷壳粉在同样的条件下进行对比试验。

１．２．３还原糖的检测参照１９５９年Ｍｉｌｌｅｒ报道的还原糖测定方法。

检测方法如下，１．１ｍＬ一定稀释度的酶解液，加入３．０ｍＬＤＮＳ沸水浴１０ｍｉｎ，５５０ｎｍ处比色，以葡萄糖为标准，测定还原糖浓度。

２结果与讨论２．１单因素试验在探索性试验的基础上考察酶解稻谷壳原料粒度、酶液用量、水解时间、水解温度各因素对还原糖得率的影响。

２．１．１原料粒度的影响分别取粒度为６０、８０、１００和１２０目经过预处理的稻谷壳粉，在其他条件相同的情况下进行对比试验，各粒度原料还原糖得率见表１，１００和１２０目还原糖的得率较高，分别为４７．６２％和４８．０５％，两者相近，考虑到粉碎成本，采用１００目的比较合适。

原料粒度对还原糖得率的影响主要是由于机械粉碎可以破坏木质素和半纤维素与纤维素的结合层，降低三者的结晶度，改变纤维素的结晶构造［７］，有利于糖苷键断裂，从而增加还原糖的得率。

同时，粒度变小会使得与酶液的接触面增大，因此也能增加糖的得率。

２．１．２酶液用量的影响酶液用量不仅直接关系到水解速度，还涉及还原糖的得率以及生产成本等问题。

在经过微波预处理的１００目的稻谷壳粉中加入一定量的去离子水和不同量的酶液，控制反应温度为６０℃，还原糖得率见表１，当酶液用量低于３０Ｕ／ｇ时，随着酶液用量的增加，还原糖得率明显增加，当超过此值时，还原糖的得率增加缓慢。

２．１．３水解温度的影响升高温度能够提高反应体系的活化能进而提高反应速度，但太高的温度又会使酶液失活，因此适当的反应温度十分重要。

取经过处理的１００目的稻谷壳粉，加入去离子水和酶液，使总酶量达到３０Ｕ／ｇ，设定不同的水解温度，还原糖得率见表１。

由表１可知，当温度为５０～６０℃时，随着温度升高，水解液中的还原糖量逐渐增加，并在６０℃时得率达到４７．１１％；当温度高于６０℃时，随着温度升高，得率有降低的趋势，因此在本试验中选取６０℃为水解温度。

２．１．４水解时间的影响在反应温度为６０℃、酶液用量为３０Ｕ／ｇ、稻谷壳粉粒度为１００目的条件下，不同水解时间内反应体系中还原糖的得率见表１，随着水解时间的延长，还原糖的得率逐渐增加，当水解时间超过１８ｈ后再延长反应时间，还原糖得率反而减小。

这说明通过１８ｈ的水解反应，反应趋于平衡。

２．２响应面分析２．２．１响应面法试验设计为了使水解工艺更加科学，在单因素试验的基础上，根据Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计原则，选择酶液用量、水解温度和水解时间３个对稻谷壳酶解影响较大的因素，以还原糖得率为响应值，设计三因素二水平试验，进行３次平行试验，每次１５组试验，得率取平均值，接下来进行响应面分析，如表２和表３所示。

２．２．２二次多元回归模型分析根据试验结果，运用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ７．１．６软件进行二次多元回归分析，得到二次多元回归方程为Ｙ＝４７．６６＋２．０３Ａ＋２．１６Ｂ＋０．６８Ｃ＋０．１４ＡＢ＋０．４９ＡＣ－０．５５ＢＣ－５．１２Ａ２－３．２０Ｂ２－２．３０Ｃ２。

方差分析结果见表４，模型的Ｐ为０．００４５，表现为极显著，而失拟项表现为不显著，复相关系数Ｒ２为０．９６２９，接近１，这表明模型与实际情况基本吻合。

且Ａ２、Ｂ２和Ｃ２的系数均为负值，表明有最优值。

从表３中看出，水解温度、水解时间和酶液用量等三因素的交互作用不显著，不能简单地通过调整交互作用提高还原糖得率，需要找到它们的最佳作用点，最大化地得到还原糖得率。

图１中显示，随着水解温度和时间的增加，还原糖的得率随之增加，但在６０℃附近开始出现下降的趋势。

这是因为在６０℃以前，升高水解温度和延长水解时间可以提高反应体系的活性，并对一些副反应有抑制作用，但当温度较高时反应体系中的还原糖会开始分解，而较长的反应时间也会加快还原糖与副产物之间的反应［８］，因此，在本试验条件下可选取５５～６５℃为适宜的水解温度范围。

图２中显示了在一定温度条件下，增加酶液用量将使还原糖得率增加；而当酶液用量一定时，过高的温度又会导致还原糖的得率降低。

这可以解释为在较低温度下，反应体系的活性较低，因此还原糖的得率相对较低，但酶液在较高的温度下又会失去活性，同样会导致还原糖的得率降低。

从图３可知，随着水解时间的延长和酶液用量的增加，还原糖的得率不断提高，在酶液用量为３０Ｕ／ｇ左右时达到峰值，继续增加酶液用量，还原糖的得率增加的趋势减缓。

这是因为稻谷壳中大分子间的β－１，４－糖苷键在酶液的作用下被打破，当酶液浓度偏低时，体系的活性也相应较低，随着酶液用量的增加，体系活性增加而有利于反应加速进行，因此还原糖的得率增加，但随着反应时间的延长，还原糖自身的分解和副反应产生的缩合反应速度也随着增加。

同时，增加酶液用量实际上是增加了酶液与稻谷壳粉的接触面积，从而提高了还原糖的得率［９］。

但当酶液与稻谷壳粉的接触面积达到一定量后，多余的酶液无法参与反应，因此还原糖的得率增加缓慢。

通过对回归方程求解得最优工艺条件为，水解温度为６１℃、水解时间为１８．８ｈ，酶液用量为３１Ｕ／ｇ，还原糖的得率为４８．２１％。

在此工艺条件下，进行验证性试验，３次试验得到的还原糖的平均得率为４６．１７％，与理论计算值非常接近，而在相同工艺条件下，未经过微波处理的还原糖得率却只有２３．５３％。

这可以认为是微波的辐射，减弱了化学键，使纤维结晶区尺寸发生变化，使反应活性得到了提高，有利于高分子化合物的降解，因而还原糖得率随之提高。