基因的分子生物学 第六章
第六章：常用分子生物学技术——RNA干扰技术
识别并切割(qiēgē)与siRNA反义链互补的靶mRNA
（5）dsRNA的再生成
第十ānrǎo)
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RNA干扰(gānrǎo)
（RNA interference, RNAi）
siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由dsRNA裂 解而成的小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要
药学 分子生物 (yào xué)
学
第一页，共四十页。
生物芯片 （biochip） (shēnɡ wù xīn piàn)
以生物、电子、机械和信息技术为基础，在 固相支持物表面建立集成、连续、微型分析系 统(xìtǒng)，形成芯片，实现对生物大分子的准确、 快速、高通量、自动化检测。
第二页，共四十页。
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REGγ基因敲除鼠（下图）出现脊椎(jǐ zhuī)弯曲等早衰现象
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Gab1基因(jīyīn)敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现 缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的 信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。
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2、 RNA干扰技术缺点
“脱靶效应”（off-target effects）
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RNA干扰技术(jìshù)的应用
1、基因功能研究（功能失活策略） “基因敲减（knockdown）”
2、基因治疗（基因(jīyīn)失活性治疗） （1）病毒感染性疾病
通过RNAi抑制 RNA病毒(bìngdú)复制 （2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）
特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片 段替代，从而使靶基因失活。
现代分子生物学第六章作业
现代分子生物学第六章作业09级一班芮世杭2220093170110271，列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。
（1）基因表达序列分析技术（SAGE）是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息在转录组水平上，任何长度超过9—10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性核苷酸的转录产物，因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9—10个碱基的核苷酸序列并制成标签。
将这些序列标签连接，克隆，测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
（2）原位杂交技术（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞，间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。
RNA原位杂交用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应。
若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，课通过反射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。
（3）基因芯片技术（FISH）对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
2，简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。
解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。
用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活，另可研究表达基因的生物学特性。
3，比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点？（1）酵母双杂交技术称Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。
第六章 基因调控1：原核生物基因的表达调控 分子生物学习题
第六章基因表达调控1：原核生物基因表达调控名词解释：操纵子基因表达持家基因正调控和负调控安慰诱导物衰减子（弱化子）魔斑结构基因和调节基因本底水平表达填空1 操纵子的基因表达调节系统属于水平的调节,乳糖操纵子模型由和1961年提出的。
色氨酸操纵子包括和两方面的调控。
2、能够诱导操纵子但不是代谢底物的化合物称为诱导物。
能够诱导乳糖操纵子的化合物就是其中一例。
这种化合物同蛋白质结合，并使之与分离。
乳糖操纵子的体内功能性诱导物是。
3、色氨酸是一种调节分子，被视为。
它与一种蛋白质结合形成。
通过控制起作用。
色氨酸操纵子受另一种系统------ 的调控，它涉及到第一个结构基因被转录前的转录。
4、大肠杆菌乳糖操纵子调节基因编码的与结合，对Lac结合，对Lac表达实施负调控；与复合物结合于上游部分，对Lac表达实施正调控。
5、操纵子中没有基因产物的是和选择题1、下面哪些真正是乳糖操纵子的诱导物？（）A.乳糖B.蜜二糖C.O- 硝基苯酚-β-半乳糖苷（ONPG）D.异丙基-β-半乳糖苷E. 异乳糖2、色氨酸操纵子的调控作用是受两个相互独立的系统控制的，其中一个需要前导肽的翻译，下面哪一种调控这个系统？（）A.色氨酸B.色氨酰-tRNA TrpC.色氨酰-tRNAD.cAMPE.以上都不正确3、阻遏蛋白(阻抑蛋白)识别操纵子中的（）A 启动基因B 结构基因C 操纵基因D 内含子E 外显子4、乳糖、阿拉伯糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是A 与启动子结合B 与DNA结合影响模板活性C 与RNA聚合酶结合影响其活性D 与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNAE 与操纵基因结合5.下面那项不属于原核生物操纵元的结构A：启动子B：终止子C：操纵子D：内含子6、下列有关操纵子的论述哪个是错误的（）A 操纵子是由启动基因、操纵基因与其所控制的一组功能上相关的结构基因组成的基因表达调控单位B 操纵子不包括调节基因C 代谢底物往往是该途径的可诱导酶的诱导物，代谢终产物往往是可阻遏酶的辅阻遏物D 真核细胞的酶合成也存在诱导和阻遏现象，因此也是由操纵子进行调控的7、操纵子调节系统属于哪一种水平的调节？A 复制水平的调控B 转录水平调控C 转录后加工的调控D 翻译水平的调控8、对调节基因下述哪些论述哪些是对的（）A 是编码阻遏蛋白的结构基因B 各种操纵子的调节基因都与启动基因相毗邻C 调节基因是操纵子的组成部分D 调节基因的表达另有转移的调控区9、以下有关阻遏蛋白的哪些是对的（）A 阻遏蛋白是调节基因表的的产物B 可诱导操纵子的阻遏蛋白具有直接与操纵子基因结合的活性，与诱导物相互作用后丧失活性C 可阻遏操纵子的阻遏蛋白没有直接与操纵子基因结合的活性，与辅阻遏物结合后才有此活性D 阻遏蛋白可与RNA聚合酶竞争同一结合部位10、关于启动基因的下述论点哪些是错误的（）A 启动基因是RNA聚合酶识别并最县结合的一段DNA序列B 启动基因是最先被RNA聚合酶转录的DNA 序列C 启动基因是DNA上富含A-T碱基对的部分D 启动基因是引发DNA复制的特殊序列11、下列有关降解物基因活化蛋白（CAP）的哪些论点是正确的（）A CAP-cAMP可专一地与启动基因结合，促进结构基因的转录B CAP可单独与启动子相互作用，促进转录C CAP-cAMP可与调节基因结合，控制阻遏蛋白的合成D CAP-cAMP可与RNA聚合酶竞争地结合于启动基因，从而阻碍结构基因的转录12、与乳糖操纵子操纵基因结合的物质是（）A RNA聚合酶B DNA聚合酶C 阻遏蛋白D 反密码子是非题1、葡萄糖和乳糖并存时，细菌优先利用乳糖并启动乳糖操纵子（）2、小分子物质如ITPG诱导乳糖操纵子表达时起负调控作用与操纵基因相结合阻抑结构基因的表达（）3、色氨酸操纵子中含有衰减子区，其调控作用主要受Trp浓度高低影响（）4、色氨酸操纵子（trpoperon）中含有衰减子序列（）5、cAMP在laz 操纵子中起正调控作用，其浓度受环境中的葡萄糖影响，与其浓度成正比（）6、大肠杆菌乳糖操纵子真正的诱导物不是乳糖，而是它的异构体别乳糖（）7、操纵基因又称操纵子，如同启动基因又称启动子一样（）8、可诱导操纵子是负责调节糖分解代谢的，可阻遏操纵子是负责调节氨基酸代谢的（）问答题：1、试述乳糖操纵子的结构及负控诱导的调控机理2、色氨酸操纵子的结构特点？其弱化子在调控中如何起作用？3、简述色氨酸操纵子中启动子调控作用特点。
郜刚分子生物学-06-DNA端粒的复制
3’ 5’ ...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT AACCCCAAC 3’ ...AACCCCAACCCC 5’ RNA template 3’
5’
端粒酶的爬行模型（动画演示） 端粒酶的爬行模型（动画演示）
母链藉非标准碱基配对回折
DNA聚合酶1970年Temin和Baltimore同时分别从 鸡)劳氏肉 年 同时分别从(鸡 劳氏肉 和 同时分别从 瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分 瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 病毒中分 离出反转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有 离出反转录酶，迄今已知的致癌 病毒都含有 反转录酶。 反转录酶。
线性DNA复制后的问题 线性DNA复制后的问题
线性DNA复制后在其新生链的5’端总是留下一段空隙，即缩短 3’
5’
3’ 3’ 5’ 5’ 3’
5’ 引物 新生链
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
两条模板链 各自复制
3’
5’
引物切除 留下空隙
3’
对于线性DNA来讲，复制时，由于受DNA聚合酶特性 限制，子代DNA链的最后一个片断去除引物后，无法 填补空隙，易造成子代DNA链的缩短。
线性线性dnadna复制后的问题复制后的问题线性dna复制后在其新生链的5端总是留下一段空隙即缩短两条模板链各自复制引物切除留下空隙引物新生链对于线性dna来讲复制时由于受dna聚合酶特性限制子代dna链的最后一个片断去除引物后无法填补空隙易造成子代dna链的缩短
线性染色体端粒 DNA的复制 DNA的复制
端粒复制的爬行模型
dGTP 5’ ...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGG 3’ ...AACCCCAACCCC 5’ 3’ AACCCCAAC RNA template 5’ dGTP 5’ ...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT AACCCCAAC 3’ ...AACCCCAACCCC 5’ RNA template 3’ 5’ Telomerase
第六章 真核生物基因表达调控教案
教案首页课程名称分子生物学任课教师李市场第6 章原核生物的表达调控计划学时 4教学目的和要求：a)真核生物的基因结构与转录活性b)真核基因的转录c)反式作用因子*d)真核基因转录调控的主要模式e)其他水平上的基因调控重点：真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。
难点：真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。
思考题：1真核基因转录调控的主要模式有哪些？第六章真核基因表达调控原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。
真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。
人类细胞单倍体基因组就包含有3×109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现"预定"的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。
真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。
第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。
转录水平调控（transcriptional regulation）；转录后水平调控（post transcriptional regulation）；翻译水平调控（translational regulation）；蛋白质加工水平的调控（regulation of proteinmaturation）等。
第六章1分子生物学改造
一、定点突变
利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入 或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基 发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓定点突变（site directed mutagenesis）。
定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。
(%) 100 100
96 106
0 95 0
0
(℃) 41.9 41.9 46.7 48.3 52.9 57.6 58.9 65.9
wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸 变体；Tm:熔点温度
将Asn和Gln转换成其他氨基酸
当蛋白质暴露于高温时:
天冬酰胺（Asn）
而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰 期则延长。
酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性
氨基酸位点
酶
14
78
半衰期（min）
野生型 Asn
Asn
13
变体A Asn
Thr
17
变体B Asn
Ile
16
变体C Thr
Ile
25
变体D Asp
Asn
天冬氨酸(Asp) + NH3
谷氨酰胺(Gln)
谷氨酸(Glu) + NH3
导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。
如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体， 每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的 表面上，可能与该酶的热稳定性有关。
第六章 重组DNA导入受体细胞
根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染
分子生物学各章节复习题
第一章1、概念：分子生物学DNA重组技术结构分子生物学“基因”的分子生物学定义：产生一条功能多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。
2、用你现有的知识解释DNA为什么是遗传信息的载体。
3、关注了解近几年诺贝尔奖获得者及其科学发现。
第二章名词解释:DNA的C值：C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
C值矛盾（C Value paradox）：C值一般随生物进化而增加，研究发现某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，而在两栖类中C值变化也很大，这种C值与生物进化（结构和组织的复杂性）矛盾的现象称为C值矛盾。
冈崎片段DNA的半保留复制（semi-conservative replication）：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。
半不连续复制（semi-conservative replication）：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。
复制子(Replicon)：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子。
转座子（transposon）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
反转录转座子（retrotransposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。
单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：在DNA复制过程中，稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
DNA连接酶: 双链DNA中一条链有切口，一端是3ˊ-OH，另一端是5ˊ-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接，不能将两条游离的DNA单链连接起来。
在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。
拓扑异构酶(DNA Topisomerase):拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解（消除）负超螺旋。
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第六章
DNA 和RNA 的结构
多核苷酸链 Polynucleotide chain
P 106
核苷 nucleoside P107 核苷酸 nucleotide
磷酸二酯键 Phosphodiester linkage
嘌呤 purine 嘧啶 pyrimidine 腺嘌呤， 鸟嘌呤 Adenine , guanine 胞嘧啶 , 胸腺嘧啶 Cytosine , thymine 异构体 Tautomeric state 碱基翻出 Base flipping 小沟， 大沟 Minor groove,
major groove P112
沃森--克里克模型
Waston --Crick model
P115 顺式 syn
P117
反式 anti 变性 denaturation
P118
杂交 hybridization 光吸收值
absorbance
P119
增色效应 hyperchromicity 熔点 Melting point, Tm
质粒 Plasmid
P120
共价闭环DNA
CccDNA, covalently closed ,circular DNA
P122
连环数 Linking number 扭转数 Twist number 缠绕数 Writhe number 互卷 interwound P123
相缠螺旋 Plectonemic writhe
环形 toroid 螺线管状 spiral 超螺旋 Supercoiling 连环差 Linking difference
P124
超螺旋密度 Superhelical density
核小体 Nucleosome
P125
拓扑异构体 Topoisomerase , Topo
链接 Catenate
P126
解开 decatenate DNA 拓扑异构体
DNA topoisomer
P130
凝胶电泳 Gel electrophoresis
溴乙锭
ethidium
P131
柄--环结构Stem -- loop structure
P133 假结pseudoknot
核酶ribozyme
内含子intron
P135 RNA剪接RNA splicing
类病毒viroid。