产脂肪酶菌株的分离_鉴定及其产酶条件优化

2010年9月第33卷第3期 湖南师范大学自然科学学报Journa l o f N atura l Sc ience ofH unan N o r m al U niversityV o.l33 N o.3Sep.,2010产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化赵 伟,王俐琼,郑 甲,周洪波*(中南大学资源加工与生物工程学院,中国长沙 410083)摘 要 从长沙岳麓山和湘江等地富含油脂的样品中分离得到一株产脂肪酶菌株CS1 1,经18S r DNA序列分析,确定该菌株为黑曲霉(A sp erg illus ni ger).对该菌株的产酶条件进行优化,发现该菌株在以体积分数为1%的橄榄油为诱导物,5g/L蔗糖为碳源,40g/L蛋白胨为有机氮源,1g/L(NH4)2S O4为无机氮源,p H为6.5的培养基中,于28 ,180r/m i n摇床培养48h,可达最大酶产量(37.60.8)mm o l!m i n-1!L-1.关键词 脂肪酶;黑曲霉;筛选;产酶条件中图分类号 Q939 文献标识码 A 文章编号 1000 2537(2010)03 0088 05Isol a tion,I dentifi c ati o n of L i p ase P roduction S train andOptm i i z ati o n of the Fer m ent ati o n Conditi o nZ HAO W ei,WANG L i q iong,ZE HNG J ia,Z HOU H ong bo(Schoo l o fM i nera ls Processi ng and B ioeng i neeri ng,Central South U n i versity,Changsha410083,Ch i na)Abst ract S tra i n CS1 1w as iso lated fro m the rich o il sa m p le of Yue l u m ountai n and X iangjiang ri v er i n Changsha c ity,w hich w as identified as As p er g illus ni g er based on18S r D NA sequence analysis.The fer m en tation conditions for li p ase production by stra i n CS1 1were opti m ized,and the m ax i m um lipase pr oducti o n o f(37.60 8)mm o l!m in!L-1w as obtai n ed at28 ,180r/m in and p H6.5after48h I ncubati o n usi n g o li v e o il(1%) and sucrose(5g/L)as co m b i n ation of peptone and carbon sources,yeast ex tract(40g/L)and a mm oniu m sulfate (1g/L)as n itrogen sources.K ey w ords li p ase;A s pergillus niger;iso lation;fer m entati o n condition脂肪酶(Lipase,EC3.1.3)也叫三酰甘油脂水解酶,是一类重要的酯键水解酶,能够在油∀水界面上催化天然油脂(甘油三脂)生成游离的脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯,广泛存在于动物、植物和微生物中[1 2].相对于动、植物脂肪酶,微生物脂肪酶具有生产成本低,易分离提纯且应用广泛,对金属离子、有机溶剂、表面活性剂的耐受性强,易于进行工业化生产等特点,使得微生物脂肪酶继淀粉酶、蛋白酶后再次掀起酶工业化应用的热潮[3 4].在产脂肪酶微生物中,细菌脂肪酶尤其是假单胞菌属(P seudo m onas)菌株所产脂肪酶被研究得最多[5],最近几十年,随着工业化应用对脂肪酶性质的不同需求,能够产生具有特定酶学性质的脂肪酶的微生物种类不断增加,目前遍及酵母菌属、霉菌属等[6 7].针对脂肪酶重要的工业应用价值和应用中所需的特殊酶学性质要求,寻找一株高产、性质特殊的产脂肪酶菌株是脂肪酶应用研究开发的基础.本实验从富含油脂的样品中筛选到一株产脂肪酶的真菌,经鉴定属于黑曲霉属,命名为A s p erg illus ni g er CS1 1,同时对该菌株的产酶条* 收稿日期:2010 07 05基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(NECT 06 0691);国家自然科学基金创新研究群体科学基金资助项目(50621063)*通信作者,E m a i:l z houhb@m ai.l 件进行了优化,获得了其最适产酶条件.本实验为后续产脂肪酶菌株的菌种改良以及脂肪酶应用于工业化大生产等工作提供了依据.1 材料与方法1.1 样品采集采自长沙岳麓山松油脂样品3份、富含油脂土样3份和湘江油污染水样3份.1.2 培养基富集培养基:蛋白胨4.0g ,酵母粉0.5g ,M gSO 4!7H 2O 0.1g ,橄榄油乳化液4mL,p H 自然;初筛油脂同化培养基:(NH 4)2SO 40.1g ,K 2H PO 40.1g ,KC l 0.05g ,M gSO 4!7H 2O 0.05g ,琼脂1.5g ,橄榄油乳化液12mL ,溴甲酚紫100 L (50m g /100mL),p H 8.0;复筛培养基:蛋白胨4.0g ,酵母粉0.5g ,蔗糖0.5g ,(NH 4)2SO 40.1g ,M gSO 4!7H 2O 0.1g ,KH 2PO 40.1g ,橄榄油乳化液4mL,p H 7.0;产孢子培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA )培养基;发酵产酶培养基:蛋白胨4.0g ,蔗糖0.5g ,(NH 4)2SO 40.1g ,M gSO 4!7H 2O 0.1g ,KH 2PO 40.1g ,橄榄油乳化液4mL,p H 7.0.1.3 脂肪酶酶活力的测定本实验采用改良的W inkler 和Stuck m an 的方法来测定脂肪酶酶活,即对硝基苯酚棕榈酸酯(p NPP)比色法[8].一个酶活力单位定义为:在上述实验条件下,每分钟水解生成1 mo l 对硝基苯酚(p NP)所需酶量定义为一个脂肪酶活力单位( m o l/m in).1.4 菌株的分离纯化将所采集富含油脂样品经富集培养后,用稀释涂平板法和平板划线分离法分离纯化出真菌,接种于油脂同化培养基平板上,在28 倒置恒温培养3d 左右,观察菌落的生长情况及水解圈的大小.选取菌株生长快、水解圈大的菌株作为脂肪酶产生菌,将该菌株接种于复筛摇瓶培养基上进行复筛,于各锥形瓶中取适当菌液离心,离心后取上清液用p NPP 分光光度法进行酶活力的测定,选取酶活最大的菌株为目的菌株。

1.5 菌株的分子生物学鉴定1.5.1 真菌基因组提取 菌株基因组DNA 提取的方法为改进的CTAB 法,此方法简单、快速且效果较好,具体步骤参照文献[9 10].1.5.2 18S r DNA PCR 扩增 以基因组DNA 为模板,利用真菌18S r DNA 引物(18F :5# CCTGGTTGATCCT GCCAG 3#,18R:5# TTGATCCTTCTGCAGGTTCA 3#)进行PCR 扩增.1.5.3 PCR 扩增产物的纯化与测序 扩增的PCR 产物用Om ega 生产的凝胶回收试剂盒纯化,操作均按说明书进行.纯化产物交由上海桑尼生物工程有限公司测序.1.5.4 序列分析及系统发育分析 将得到的18S r DNA 测序结果提交到NCB I 数据库并进行BLAST 比对,找到并下载典型的菌株序列与实验菌株的序列用C lustal X2.0软件进行同源性分析,并用MEGA3.1软件构建系统发育树.1.6 产酶条件优化1.6.1 温度对产酶的影响 不同的温度条件下,黑曲霉的生长状况有差别,产脂肪酶的能力也有差异.为了使其在较好的生长条件下能达到最佳的产酶条件,特将筛选得到的菌株以发酵产酶培养基为基础,置于不同的温度下(26,28,30,32,34 )培养,以检测其最佳产酶温度.1.6.2 初始p H 对产酶的影响 由于p H 值对黑曲霉本身生长和产脂肪酶能力的影响较大,为使HB 03菌株达到最佳的产酶条件,特设定不同的p H 梯度(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)以得到该菌株产酶的最佳p H 值.1.6.3 不同诱导物对产酶的影响 研究表明不同的诱导物对菌株产脂肪酶的能力有很大的影响,因此,设定不同的诱导物验其对菌株产酶能力的影响.1.6.4 不同碳源对产酶的影响 黑曲霉可以利用不同的碳源生长产酶,但是碳源不同,会有不同的产酶能力.为了验证该菌株能更好地利用哪种碳源进行产酶,特设定几种5g /L 不同碳源(蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、糊精、乳糖)的发酵培养基进行实验.1.6.5 不同氮源对产酶的影响 和不同碳源种类对黑曲霉产酶影响的原理相同,培养基中不同氮源的对也89第3期 赵 伟等:产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化它的产酶能力有很大的影响,因此,设定不同的氮源进行验证,以便找到它产酶的最适氮源.1.6.6 金属离子对产酶的影响 本实验考察了金属离子Ca 2+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 2+和M g 2+对CS 1 1菌株产脂肪酶的影响.1.6.7 不同培养时间对产酶的影响 本实验旨在考察筛选得到的菌株生产脂肪酶随时间变化的规律,从而确定最佳的产酶时间.2 结果与分析2.1 产脂肪酶菌株的分离与鉴定通过初筛和复筛,从富含油脂样品分离得到多株具有产脂肪酶能力的菌株,其中有一株的产酶能力较强,能达到(37.6 0.8) m o l/m i n ,命名为CS 1 1,经表型鉴定和18S r DNA 鉴定为黑曲霉(图1).黑曲霉有着发酵成本较低,较宜成活等优势,使其在发酵工业中更具有优势.本研究通过特异性引物设计,成功扩增出该菌的脂肪酶基因(GenBank 基因序列号:HM590646).图1 CS 1 1菌株的18S rDNA 系统发育树2.2 A sper g ill u s n i g er CS 1 1产酶条件2.2.1 温度对产酶的影响 不同的生长温度对微生物的生长速率、代谢速率以及对其产物的累积等有重要的影响.最适的生长温度不仅可以促进微生物的生长,同时还可以大大增加微生物产物的产量.从图2可以看出,CS 1 1菌株在一定的温度范围里,菌株的产酶能力随温度的升高而增加,在28 条件下培养可以达到最大酶活,但当温度高于28 时菌株产酶能力迅速下降.2.2.2 初始p H 对产酶的影响 初始p H 值对微生物的生长及物质代谢影响很大,主要作用在于:引起细胞膜电荷的变化,从而影响微生物对营养物质的吸收;影响代谢过程中酶的活性;改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性.黑曲霉的生长p H 值范围较广,但通常其最佳生长p H 值为6~7,根据图3可以看出,在p H =6.5时CS 1 1菌株有最大酶活力.在碱性条件下,酶活力整体趋势是下降的,因为在碱性条件下,黑曲霉的生长受到抑制,但其对碱性条件还是有一定的耐受性.2.2.3 诱导物对产酶的影响 不同的诱导物对微生物产生脂肪酶有不同的影响,适合且适量的诱导物能促使细胞分泌脂肪酶从而能显著增强脂肪酶的产量.图4是体积分数为1%的各种诱导物对黑曲霉CS 1 1菌株产酶的影响,结果表明1%的各种油脂都能诱导细胞产生脂肪酶,其中橄榄油是其最佳诱导物.2.2.4 碳源对产酶的影响 在发酵培养基的基础上,对CS 1 1菌株的碳源进行了优化.从图5可以看出,6种碳源对CS 1 1菌株的产酶能力影响差异还是比较大,其中,菌株利用葡萄糖和乳糖产酶的能力相似,而可溶性淀粉和蔗糖则能促进脂肪酶的产量,其中5g /L 的蔗糖是其最适碳源.90 湖南师范大学自然科学学报 第33卷2.2.5 氮源对产酶的影响 氮源在微生物的生长代谢中发挥着举足轻重的作用,合适的氮源能显著增加脂肪酶的产量.从图6可以看出,尿素、牛肉膏、黄豆粉等氮源对CS 1 1菌株的产酶影响较小,而40g /L 的蛋白胨能增强其产酶能力,因此蛋白胨是其最适氮源.2.2.6 金属离子对产酶的影响 研究表明在培养基中加入一定量的金属离子能大大影响脂肪酶的产量.从图7可以看出,Cu 2+对CS 1 1菌株的产酶能力有显著的抑制作用,而Ca 2+、M g 2+等能增强CS 1 1菌株的产酶能力,但Fe 2+对产酶的影响不大.图6 不同氮源对产酶的影响 图7 金属离子对产酶的影响2.2.7 培养时间对产酶的影响 为了确定CS 1 1菌株的最佳产酶时间,把CS 1 1菌株在优化好的产酶发酵培养基中培养72h ,从图8可以看出,CS 1 1菌株在前48h 里,其脂肪酶产量都随时间的增加而增加,随后其产酶能力慢慢下降,当培养到48h ,CS 1 1菌株能达到其最大脂肪酶产量37.6 0.8mm o l !m in -1!L -1.91第3期 赵 伟等:产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化图8 培养时间对产酶的影响3 结论与讨论作者为寻找低温偏酸的脂肪酶,经初筛、复筛从长沙岳麓山和湘江等地取的样品中分离到一株产脂肪酶的菌株CS 1 1,其产酶性质较好,酶活较高,利用18S r DNA 序列分子方法对其进行了系统发育分析,确定了其属于黑曲霉.对该菌株的产酶条件进行优化,发现了该菌株在以体积分数为1%的橄榄油为诱导物,5g /L 的蔗糖为碳源,40g /L 的蛋白胨为有机氮源,p H 为6 5的培养基中,于28 ,180r /m in 的摇床培养48h ,可达最大酶产量(37.60 8)mm o l !m i n !L -1.目前,国内对黑曲霉脂肪酶的报道较少,而国外研究得较多.Nutan D .M ahad i k 等[11]通过对As p er g illus niger NC I M 1207进行紫外诱变筛选,其产酸性脂肪酶能力比诱变前增大了7倍,达到41mm ol !m in -1!L -1,同时在培养基中加入葡萄糖能显著增加其产酶能力,胡麻油和橄榄油同时对As p er g illus ni g er NC I M 1207的诱导效果都较好.N.R .Ka m i n i 等[12]报道了用芝麻油饼对As p er g illus ni g er MTCC 2594进行固体发酵,发酵72h 得到脂肪酶的活力为363.6 m o l !m in -1!g -1干底物.参考文献:[1] KAU S H I K R ,S ARAN S ,ISAR J ,et al .Statisti ca l opti m izati on of m ed i u m co m ponents and g row th cond iti ons by response surface m ethodo l ogy to enhance li pase producti on by A sp erg illus ca rneus[J].Journa l o fM o lecular C ata l ysis B :Enzy m atic ,2006,40:121 126.[2] MA CRA E A,HAMM OND R.P resent and f uture app licati ons of li pases[J].B iotechno logy &G ene ti c Eng i neer i ng R ev i ew s ,1985,3:193 217.[3] 肖春玲.微生物脂肪酶的研究与应用[J].微生物学杂志,1997,17:56 59.[4] 孙宏丹,孟秀香,贾 莉,等.微生物脂肪酶及其相关研究进展[J].大连医科大学学报,2001,23:292 295.[5] TRE IC HEL H,de OL I V EI RA D,M AZU TT I M,et al .A rev i ew on m i crob ial li pases produc tion [J].Food and B ioprocessT echno l ogy ,2010,3(2):182 196.[6] CI HANG I R N,S AR IKAYA E .Investi ga ti on o f li pase producti on by a ne w i solate o f A sperg illus sp[J].W o rl d Journal ofM icrob i o l ogy and B iotechnology ,2004,20:193 197.[7] CARDE NA S F,ALVAREZ E ,CA S TRO ALVAREZ M,et a l .Screen i ng and cata l y ti c acti v ity i n org an i c synthes i s o f novel f unga l and yeast li pases[J].Journa l o fM o l ecular Cata lysis B :Enzy m a tic ,2001,14:111 123.[8] W I NKLER U,STU CKMANN M.G l ycogen ,hya l uronate ,and so m e other po l ysaccharides g rea tly enhance the for m ation o f exoli pase by Serrati a m arcescens[J].Journa l o f Bac teriology 1979,138:663.[9] 易润华,朱西儒,周而勋.简化CTA B 法快速微量提取丝状真菌DNA [J].湛江海洋大学学报,2003,23(6):72 73.[10] 夏金兰,张瑞永,张 倩,等.一株纤维素降解菌的分离、鉴定及降解特性初步研究[J].湖南师范大学自然科学学报,2008,31(4):86 90.[11] NU TAN D M,KU LB HU S HAN B B ,U LKA S ,et al .P roducti on o f ac i d ic lipase by a mutant o f A sp erg ill us ni ger N CI M 1207insub m erged fer m enta ti on[J].Process B i oche m i stry ,2004,39:2031 2034.[12] KAM I N I N R,MA LA J G S ,PUVANAKR IS HNAN R.L i pase producti on from A sperg il uus n i ge r by so lid sta te fer m entati on usi ng g i nge lly o il cake[J].P rocess B i ochem istry,1998,33(5):505 511.(编辑 王 健)92 湖南师范大学自然科学学报 第33卷。