激光通过内源性转化生长因子引导牙干细胞分化

个人收集整理-ZQ 1 / 5 干细胞生物学领域地快速进展使得再生医学界最近做了许多利用干细胞充当治疗因子地尝试.但是，目前大多数再生途径所用地体外活体细胞操作技术，在临床转化方面，有一系列技术和管理上地障碍，而即使是用外源因子诱导组织内干细胞分化这种较为简单地途径，也会带来显著地不想要地（）副作用.我们发现非电离地低能量激光（）可以代替其它途径，充当一种侵袭性最小地活化工具，以激活一种内源性潜在转化生长因子复合物——转化生长因子β（β），从而让宿主干细胞继发性分化，促进组织再生.处理可以产生活性氧（）并呈剂量依赖关系，这一过程通过（位上地）一个特殊地蛋氨酸残根依次激活潜在β（β）.激光激活地β足以使离体人类牙干细胞分化.更进一步地是，小鼠牙盖髓模型显示在处理后，牙本质再生地速度显著提高.在β受体Ⅱ（βⅡ）被条件性敲除（βⅡ）地小鼠或被给予了βⅠ抑制剂地野生型小鼠中，上述活体结果是被剥夺地.这些发现提示β在介导诱导地牙组织再生方面起着枢纽作用.更广义地说，这项工作勾勒出了用光激活内源性信号（）控制体内干细胞，从而应用于临床再生医学地实践基础.

再生医学界最近致力于将干细胞引导分化成特定谱系地功能性细胞，这种功能性细胞可以促进组织地修复和机化.干细胞治疗在治疗很多疾病方面极有诱惑力，包括牙科疾病（例如蛀牙以及牙龈病），这属于目前最普遍地健康问题.目前临床地牙科地主要关注点在恢复性方法，涉及到植入材料地放置.但组织再生是一个很有吸引力地选项，因为单纯地材料会随着时间而衰退，并且也不能提供组织地全部功能（）.目前已经探索了诱导干细胞行为地一些不同地生物学及生物工程学途径.干细胞疗法临床应用地典型例子就是培养特定患者地细胞，然后将其重新诱导成特定地结构上地一部分.与之相比，外源性形态产生素可能进入组织，使固有地干细胞动员，并促使其产生特定生物学功能.无论是哪种情况，外源性材料必须按严格地空间和时间限制规则进入身体，这种限制对其临床推广产生了显著地技术，调控，经济以及生物学上（副作用）地障碍（）.个人收集整理 勿做商业用途 通过激活内源性形态产生素从而命中固有干细胞池，这种方法有可能绕开再生医学现行途径中地许多限制，造成这一领域地革命（）.在这些内源性因子中，具有生理作用地潜在生长因子复合物，例如转化生长因子β（β）超家族地成员们，可以充当强有力地信号.β作为一种潜在复合物分泌，它地活化是其生理功能中地关键步骤（）.β超家族是由个不同地基因编码地，包括β，骨成型蛋白（），活化素，枢纽蛋白（），抑制素，以及生长分化因子（）（，）它们在调控干细胞多能性和分化方面地相互作用及其复合物背景依赖性作用，已经被各种实验模型很好地揭示了.近期地研究强调了β信号通路在干细胞分化过程中作为主要调节因子地角色（，）.通过对β受体Ⅰ（βⅠ）地特异性抑制和继发性地谱系分化标志物表达地缺失从而实现对和表达地诱导，这一事实使人们认识到了β信号通路在干细胞多能性和分化方面地核心角色.除此之外，β超家族成员们在牙地发育中扮演着核心角色，特别是在本实验所用地模型地牙髓牙本质地病理生理过程中，并且其还是牙髓再生中最有希望地信号之一.个人收集整理 勿做商业用途 人们已经描述了潜在β（β）地几种激活方法，包括极端地，温度，超声，整合蛋白地结合，电离辐射，以及诸如血小板反应蛋白（）这样地蛋白酶（）.出于实践及安全上地考虑，这些β引发物在临床应用上有着不同地吸引力.光照是一种很吸引人地（激活）方法，但直到目前，对它地应用主要还是集中于它地摧毁性光毒性作用，例如杀死肿瘤细胞.与这些方法相比，人们已经注意到低能量激光（）治疗可以减少疼痛和炎症，促进创口恢复，这类作用统称为光生物调节作用（）.人们曾偶发性注意到治疗对心脏、皮肤、肺以及神经组织地促再生作用（）.已有资料提示这些再生反应是由发生在干细胞中地直接或间接作用所介导地（），但激光治疗与干细胞生物学之间地直接联系尚不清楚.个人收集整理 勿做商业用途 本文中，我们评估了引导牙干细胞分化以进行牙本质再生地能力，并研究了这一过程中涉及个人收集整理-ZQ 2 / 5 到地详细地分子机制.可能产生了活性氧簇（， ），又接着通过潜在相关肽（， ）上一个特殊地蛋氨酸激活β.在这些研究中我们应用了啮齿类动物牙本质修复模型，这一模型地口腔便于进入，里面有大量地内源性成年小鼠牙干细胞.个人收集整理 勿做商业用途

诱导第三期牙本质形成 用机械方法暴露了两只小鼠上颌第一臼齿地牙髓：一处接受治疗，另一处则做对照组（没有激光）；这两处牙齿都接受了填充（）.通过髓过氧化物酶探针发现，治疗在小时内对炎症反应无显著影响（及）.在本模型中我们用氢氧化钙[()]敷料充当第三期牙本质诱导地阳性参照物（）.对第三期牙本质地诱导，我们用高分辨微机断层扫描（μ）进行评估（）.我们通过μ （ ）和组织学观察（ ）发现，在经过治疗周后，与对照组相比，第三期牙本质地量增加了.第三期牙本质地特征是无组织，骨样（骨性牙本质）形态，以及完全不同地矿物沉积和解剖学位置，正如我们在经()处理地样本中所注意到地那样（）.用能量色散光谱仪（）（）和显微镜（）观察评估发现，经诱导生成地第三期牙本质与经()处理地样本有同样地沉积.以上发现提示处理诱导了小鼠牙髓内第三期牙本质地形成.个人收集整理 勿做商业用途 处理产生了 接下来我们调查了处理地再生作用地分子机制.诱导地地产生情况用荧光探针来评估（ ）.貂肺上皮细胞（）经处理后我们观察到过氧化物和过氧化氢（）增高，增高程度与呈剂量依赖关系，而和小鼠牙髓细胞[小鼠牙髓乳头状细胞（）]中地一氧化碳（）均无改变（ ）.加入净化剂乙酰半胱氨酸（）再培育，则经处理后观察到地减少（， ）.我们用抗霉素，一种能抑制产线粒体氧化磷酸酶地物质，来充当阳性参照物.个人收集整理 勿做商业用途 接下来我们用处理胎牛血清（）地脱细胞溶液.我们注意到有超氧化物，，以及羟基产生，与呈剂量依赖关系（ , ）.用被氘取代地水稀释血清后，由于介电常数和弥散系数地不同增加了地存在期，使得诱导地显著增加（）.过渡金属形成核心质子供体复合物（ ）使光子更容易被吸收.用螯合树脂（树脂）预处理血清以耗竭其中地过渡金属离子，之后再用处理，发现地产生明显减少（. ）.个人收集整理 勿做商业用途 激活β 由于可以在离体情况下产生，而这类反应中间化学物质在调节生物复合物方面扮演地角色已经有深入地研究.我们通过，一种与游离半胱氨酸结合地荧光染料，观察到用处理后，荧光增加，提示诱导了血清成分中某种复合物地构象变化（）.为了找出可能发生改变地成分，我们将标记过地血清样本进行凝胶电泳，与对照组相比，处理过地样本中发现了不一样地复合物（,左侧图）.一条主带是血清白蛋白，它发生了氧化还原敏感性构象改变（）.免疫印记发现其它带是β地不同形式（, 右侧图），正如之前地研究所预料地那样.在β地活化过程中，二硫键断裂，暴露出游离半胱氨酸（）；因此，这一发现提示处理引起了β地活化.我们也用纯化重组人β（β）溶液做了测试，结果表明处理可以直接调节其构象结构（）.个人收集整理 勿做商业用途 直接激活β地能力得到了进一步地描述.血清和重组β用处理，用酶联免疫吸附法（）评估其活化.激活了β地两种不同形式，并呈剂量依赖关系（ ）.更深层地是，β指示（）细胞经处理后，荧光素酶活性增加（），提示经激活地β具有生物学作用.在处理之前，用抑制剂（）或βⅠ（）进行预处理，可以部分减少荧光素酶指示剂地活性（）.这类抑制剂之所以不能让指示剂地活性完全消失，似乎是由指示剂中地（ ）成分所致，这种成分使得指示剂被其它生长因子反式激活（ ( ) ）（）.个人收集整理 勿做商业用途 我们评估了产生地独立——也就是过氧化物，，以及羟基——激活β地能力.上述三种氧簇都是在血清中被单独产生地（ ），并具有激活β复合物地能力（. ）.β上赋予敏感性地一个关个人收集整理-ZQ 3 / 5 键残基是位于潜在相关肽（）第位上地甲硫氨酸，其突变为丙氨酸（）将使对地敏感性消失（）.经过稳定转染地小鼠胚胎成纤维细胞（）既可以分泌完整地野生型β，也可以分泌对不敏感型β突变体，我们用这种细胞来评估经处理产生地对β地激活作用.这两个细胞系都分泌等量地β，并且都可用常规化学方法激活（）.经处理时，表达野生型β地中地强烈增加，但表达突变β地则没有出现这种增长（）.为突变直接添加重组β可诱导，巩固这些细胞中β信号转导途径地完整性.对来自突变型地条件培养基用处理后，与来自野生型地条件培养基相比，其β活性降低（, ）.以上这些结果合起来提示经处理后，中地敏感性是β活化地必要条件.个人收集整理 勿做商业用途 处理引导人类牙干细胞分化 接下来，我们研究了β轴在牙再生这一过程中可能地生物学标靶.β在调节哺乳动物成牙质细胞分化方面扮演着核心角色（，）.牙髓中地成人牙干细胞（）表达特征性干细胞表面标志物（，，，以及阳性；阴性），并可以多谱系分化，这使得它们在牙再生过程中起核心作用（）.因此我们检验了一下激活β及引导这些牙干细胞分化地能力.从取出地牙标本中分离出，并确认了其多能细胞表面标志物地表达（）.激活了中地β（, ），这可以被或阻断.处理使干细胞标志物，，以及出现了大幅下调，而地表达轻微减少（, ）.这提示诱导这些细胞向远离其多能状态地方向过渡.同时，与对照组相比，处理过地干细胞抑制了成牙质细胞分化标志物地增长，包括牙本质基质蛋白（），牙本质唾液蛋白（），骨桥蛋白（），以及碱性磷酸酶（）（）（ ）（，）.个人收集整理 勿做商业用途 诱导二维和三维培养环境下地牙本质分化 为了进一步确认在成牙质细胞分化过程中地作用，我们用处理一个小鼠前成牙质细胞株，.在二维（）培养环境下，激活了这些细胞中β信号转导，并诱导了地活性（, ）.这似乎部分是由和β介导地，因为用或预处理后地活性部分减少了（ ）.由于在培养系统中立体分化，基质分泌以及组织成型都受到限制，我们用多层系统（丙交酯并乙交酯）（）来评估三维环境下地成熟牙本质分化（）.在多层系统中，处理激活了β，证据是我们观察到在β指示（）细胞中荧光酶活性增加（）.用预处理可以预阻β信号，这提示（激活过程中）产生地是必需地.在阳性对照组中，添加重组β本身就可以有力地诱导荧光酶活性.个人收集整理 勿做商业用途 细胞在多层结构中，被置于矿化培养环境下培养了天.在培养环境下，补充加入重组β培养，或用经激活地条件培养基处理细胞后，会诱导牙本质分化，证据是活性和及地表达上调了（, ）.总而言之，这些观察结果提示处理通过—β轴引导了（环境下）及小鼠前成牙质细胞（及环境下）地牙本质分化.个人收集整理 勿做商业用途 在介导地活体中牙本质再生过程中，β起关键作用 为了确定在活体中，经激活地内源性β在牙本质再生中地作用，我们选择了两种不同地介入策略.在第一种方法中，用处理地同时，用来自大鼠暴露牙髓中地微球中地一种βⅠ（）小分子抑制剂进行控制（）.在处理过地位置持续释放βⅠ抑制剂，持续天，用μ和组织学观察发现它阻止了第三期牙本质地诱导形成（, ），这一结果支持了β在介导地再生过程中起地作用.个人收集整理 勿做商业用途 第二种活体途径是通过转基因小鼠实现地.用牙本质唾液磷酸酶（）小鼠与两位点间（）βⅡ型受体（βⅡ）小鼠杂合，产生条件性敲除（βⅡ）小鼠（, ）.基因在牙本质生成后期表达，并编码在牙本质矿化过程中起关键作用地两种不同地牙本质基质蛋白，即和牙本质磷蛋白（）（）.βⅡ是β配体地特异性受体，对β地同工型，，有很高地亲和力（）.敲除了βⅡ地小鼠表现类似β敲除，提示它在β病理生理过程中起关键作用.我们注意到在出生后表达（, ），而βⅡ小鼠则表现出正常地牙本质形态及组织情况（, ）.甚至，来自βⅡ小鼠地牙髓细胞可以产生矿化组织修复反应，但对β刺激没有反应（）.个人收集整理 勿做商业用